[发明专利]一种基因重组人C肽融合蛋白及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种基因重组人C肽融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒S片段从167至224氨基酸片段的58个氨基酸即LCMVs(167-224)与人C肽的全序列31个氨基酸串联形成的融合蛋白——LCMVs(167-224)-C肽；LCMVs(167-224)在融合蛋白的N端，人C肽的全序列在融合蛋白的C端；LCMVs(167-224)氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，人C肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；所述基因重组人C肽融合蛋白中的LCMVs(167-224)和人C肽两个片段之间由2-10氨基酸连接。

2.根据权利要求1所述的基因重组人C肽融合蛋白，其特征在于：所述的连接用的氨基酸从N端至C端依次为天冬氨酸、甘氨酸和精氨酸。

3.根据权利要求1所述的基因重组人C肽融合蛋白，其特征在于：所述的基因重组人C肽融合蛋白的两端加入标签。

4.根据权利要求1所述的基因重组人C肽融合蛋白，其特征在于：所述的基因重组人C肽融合蛋白的N端加入6个组氨酸。

5.根据权利要求1所述的基因重组人C肽融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白的蛋白序列为SEQ ID NO：3所示；编码该融合蛋白的基因序列为SEQ ID NO：4所示。

6.一种表达权利要求1所述的基因重组人C肽融合蛋白的表达载体。

7.一种包含权利要求6所述的表达载体的宿主细胞，该表达载体为：LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K。

8.一种权利要求1所述的基因重组人C肽融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤包括：

（1）利用毕赤酵母密码子偏好表或专业的密码子优化网站分别对LCMVs(167-224)和人C肽蛋白基因优化为毕赤酵母偏好序列；

（2）交由商业公司合成上述优化后的基因；

（3）利用软件设计扩增LCMVs(167-224)和人C肽基因的上下游引物，并在LCMVs(167-224) 基因上游引物和人C肽基因下游引物中加入合适的酶切位点及保护碱基，LCMVs(167-224) 基因下游引物和人C肽基因上游引物中加入连接氨基酸的基因密码和互补序列；

（4）通过PCR的方法，由一系列的温度控制，使得LCMVs(167-224)和人C肽基因得以扩增，之后利用两扩增基因中含有的互补序列，再次PCR得到融合基因LCMVs(167-224)-C肽；

（5）使用常规的酶切、连接方式克隆LCMVs(167-224)-C肽至一个毕赤酵母表达载体；

（6）含有LCMVs(167-224)-C肽的毕赤酵母表达载体经过酶切线性化、乙醇沉淀后，转化入毕赤酵母工程菌；

（7）使用常规的毕赤酵母培养基培养工程菌，低浓度的甲醇诱导目的蛋白表达，后分离出上清，用C肽免疫比浊试剂盒检测筛选得到表达较高的菌落；

（8）使用合适的条件保存该菌种，取该菌种放大培养，诱导表达LCMVs(167-224)-C肽融合蛋白；

（9）通过层析的方法从该酵母的发酵液中纯化获得LCMVs(167-224)-C肽融合蛋白。

9.一种权利要求1所述的基因重组人C肽融合蛋白在用于制备免疫动物来获得C肽抗体中的应用。