[发明专利]DNA Marker的制备方法及其质粒和质粒的制备方法

说明书

本发明提供一种DNA Marker的制备方法及其质粒和质粒的制备方法，其特征在于，包括：预定长度的多条DNA Marker片段，各片段之间具有相同的酶切位点。本发明通过在载体构建过程中合理搭配不同大小的DNA片段及其拷贝数，使得质粒DNA通过完全酶切后，一次性得到DNA Marker中各条带，且各条带之间的亮度基本一致，从而实现DNA Marker在凝胶上的均一性。

技术领域

本发明涉及一种DNA Marker的制备方法，本发明涉及在上述DNA Marker的制备过程中所构建的质粒，本发明还涉及上述质粒的制备方法，属于基因工程领域。

背景技术

基因工程又称重组DNA技术，是指在体外在分子水平上对DNA进行切割、连接、修饰等一系列操作的过程，在生命科学、生物医学领域起到了非常巨大的作用。在对DNA的体外操作中，涉及到DNA分子的分离、纯化、切割、修饰、连接、扩增、序列测定等许多过程，其中，最基础而且应用非常广泛的一项操作是DNA的电泳。DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备、检测、浓度测定、目的DNA片段的纯化，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。DNA分子量标准物(DNA Marker)是分子生物学实验中必不可少的用于确定目的DNA片段大小的标准参照物。DNA片段与DNA Marker在同一块琼脂糖凝胶中进行电泳迁移，通过比较迁移率可以估算出目的DNA的大小。

尽管实现DNA Marker的原理非常简单，但要制作低成本高质量的DNA Marker还是有相当的难度。目前各实验室中DNA Marker的使用大部分是从商业公司购买，而且由于DNAMarker是消耗品，每个实验室中的使用量非常大，具有广阔而良好的市场前景。目前，许多生物公司也为此开发了多种针对不同应用的，具有不同分子量范围的DNA Marker产品。按照DNA Marker制备所涉及的关键技术,其制备方法可以分为限制性内切酶酶切和PCR扩增两种方法；其中限制性内切酶酶切的DNA分子的来源又可以分为天然的基因组DNA和人工构建的质粒载体。PCR扩增又可分为单片段的扩增和多片段的扩增。

PCR扩增法是最常用的。虽然工作简单，但是重复成本高，长片段扩增效率低，并且还需要在回收后根据产物的亮度合理配比以达到最佳效果，可重复性差。酶切质粒的方法前期投入大，但是可以在前期设计的时候充分考虑各个分子量大小的浓度配比，使得酶切后的各分子量级别浓度达到最佳状态，并且产品各批次之间的基本没有差异。

酶切的方法又分为部分酶切和完全酶切。部分酶切是将具有某种单位长度而且带有设计好的酶切位点的片段顺序连接到载体中，通过控制酶的活性，温度和反应时间等酶切条件，实现载体的部分酶切，酶切产物将是质粒上该单位长度的倍数的片段。该方法是用于以单位长度递增的DNA Marker(比如100bp DNA Ladder，条带为100bp，200bp，300bp等依次递增)的制备，其优点是制备方便，条带分布均匀，但其缺点是部分酶切的程度难以掌握，条带亮度与酶切的完全程度相关。完全酶切是将设计好的一组不同大小的DNA片段克隆到特定的载体中，经过大肠杆菌扩增后，将纯化得到的质粒DNA通过完全酶切，获得相应大小的DNA片段。该方法制备的DNA Marker质量较好。

综上，在目前DNA Marker的生产过程中，主要采用的PCR扩增的方式，虽然该方法简单，但是一种劳动密集型的，难以保证批次之间重复性的生产，从而难以实现大规模生产，总体成本较高的方法。酶切法中的人工构建DNA分子的酶切是将来技术发展的主流。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有DNA Marker质粒的制备方法以及DNA Marker的制备方法，以能够通过大规模生产得到质量稳定均一的DNA Marker。

本发明采用了如下技术方案：

本发明提供一种含有DNA Marker的质粒，其特征在于，包括：预定长度的多条DNAMarker片段，各片段之间具有相同的酶切位点。