[发明专利]DNA Marker的制备方法及其质粒和质粒的制备方法

权利要求书

1.一种含有DNAMarker的质粒的构建方法，包括如下步骤：

A、取多条长度不同的DNAMarker片段，各长度的DNAMarker片段的拷贝数为一个或多个；

其中，DNAmarker片段中包括100bp的片段，100bp片段的合成方法如下：首先合成引物组：第一引物100-1：5’-CGGAATTCTTCTCATGCTGAAAACGTGG-3’和第二引物100-2：5’-GGATCCAGGCTCTGCG GGCCCGGCGT-3’，

第三引物100-3：5’-GGATCCGTTTCTGCGGGAAAGTGTTC-3’和第四引物100-4：5’-GGATCCGACATCCCGGCAAGCATGGC-3’,

第五引物100-5：5’-GGATCCATCCACGGAGTATGCCGAC-3’和第六引物100-6：5’-GGATCCGAGCACGGTG TACGTCAGCC-3’，

第七引物100-7：5’-GGATCCAGCCTGTTTTTCAGCGATC-3’和第八引物100-8：5’-GGATCCTCTGCATCAGCACATCATC-3’，

第九引物100-9：5’-GGATCCAAGCGGCAGGGCTTGCCGG-3’和第十引物100-10：5’-GGATCCATTACGTCATCCTCCGTC-3’，

然后以λ噬菌体DNA为模板，用Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得5种100bp片段，回收备用，

其中，DNAmarker片段中具有200bp的片段，200bp片段的合成方法如下：首先合成三对引物：第十一引物200-1：5’-GGATCCGCTGATGACAGTATCAGAAG-3’)和第十二引物200-2：5’-GGATCCCAGCGCCTGTCGGCTCAGCG-3’，第十三引物200-3：5’-GGATCCGCTGCACAGAAAGCGGGG-3’和第十四引物200-4：5’-GGATCCAGGGTGATCGCACCGGCAAG-3’，第十五引物200-5：5’-GGATCCGCCGATGGTGGGGGCCAC-3’和第十六引物200-6：5’-GGATCCACTCGCTGGTCTGGTTAAAC-3’，然后以λ噬菌体DNA为模板，用Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得三种200bp片段，回收备用，

其中，DNAmarker片段中具有300bp的片段，300bp片段的合成方法如下：首先合成两对引物：第十七引物300-1：5’-GGATCCCACTCAGCGCACTGGTTAAG-3’和第十八引物300-2：5’-GGATCCGGCGGCGGGTCTGGTCATC-3’，第十九引物300-3：5’-GGATCCTGAAAGAGAACATGGGCAC-3’和第二十引物300-4：5’-GGATCCGCTGCTGCGCATTTTTG-3’，然后以λ噬菌体DNA为模板，用PfuDNApolymerase进行扩增，获得两种300bp片段，回收备用，

其中，DNAmarker片段中具有400bp的片段，400bp片段的合成方法如下：首先合成两对引物：第二十一引物400-1：5’-GGATCCAGAGCGATACCGAAGCGTC-3’和第二十二引物400-2：5’-GGATCCTGGCGACGTTGCGCCGCC-3’，第二十三引物400-3：5’-GGATCCGCTGTCTGCACAGGAGAAATC-3’和第二十四引物400-4：5’-GGATCCACTTTTTACCTGCGACATAC-3’，然后以λ噬菌体DNA为模板，用Pfu DNApolymerase进行扩增，获得400bp片段，回收备用，

其中，DNAmarker片段中还具有500bp的片段和700bp的片段，500bp片段的合成方法如下：首先合成引物：第二十五引物500-1：5’-GGATCCGCAGCCACGCAGACCTTTG-3’和第二十六引物500-2：5’-GGATCCGGACCTATCTGCCCGTTCG-3’，然后以λ噬菌体DNA为模板，用PfuDNApolymerase进行扩增，获得500bp片段，回收备用；700bp的片段合成方法如下：首先合成引物：第二十七引物700-1：5’-GGATCCGGCTGCTCTGAAGGCGGTG-3’，第二十八引物700-2：5’-GAATTCTCCCGGTGACCATACCG-3’，然后以λ噬菌体DNA为模板，用Pfu DNApolymerase进行扩增，获得700bp片段，回收备用，

B、通过重叠PCR拼接各DNAMarker片段，拼接后的片段称为外源片段，外源片段中的DNAMarker之间具有相同的酶切位点，外源片段两端与骨架载体连接处的酶切位点与片段中间的酶切位点不同；

C、选择质粒作为骨架载体，且该骨架载体上不带有EcoR I酶切位点，随后将外源片段连接进入骨架载体，构建得到一个重组质粒。

2.一种DNAMarker的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

A.利用如权利要求1中所使用的方法，构建用于制备DNAMarker的质粒；

B.将该质粒转入宿主菌中进行扩增；

C.提取质粒，采用限制性内切酶将质粒切分为外源片段和骨架载体；

D.使用琼脂糖凝胶层析柱收集所述外源片段；

E.得到的外源片段采用与外源片段内部的酶切位点对应的限制性内切酶进行酶切，从而得到DNA Marker各条带。