[发明专利]基于微流控技术的CTC蛋白质分型试剂盒

说明书

本发明涉及一种基于微流控技术的CTC蛋白质分型试剂盒，包括有：(1)针对不同CTCs标志蛋白质的捕获抗体复合物：每种捕获抗体复合物由与对应的标志蛋白质特异性结合的捕获抗体和适配体通过可剪切材料连接而成，所述可剪切材料为具有2个或2个以上的限制性内切酶位点的回文结构的脱氧核糖核苷酸双链；(2)表面偶联有细胞捕获组件的微流控芯片：该微流控芯片表面固定有由微柱构成的细胞捕获组件，所述微柱的一端修饰有能与适配体发生结合反应的特异性结合物。本发明采用微流控技术实现了对CTCs高效、快速的自动化检测和分型，操作简单，减少人为操作因素造成的假阴性和假阳性结果，提高了检测的灵敏度和准确性。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种基于微流控技术的CTC蛋白质分型试剂盒，适用于血液中循环肿瘤细胞的捕获、分离纯化和分型鉴定。

背景技术

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)来源于原发肿瘤或转移肿瘤，获得脱离基底膜的能力并通过入侵组织基质进入血管，是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。根据其表面抗原的表达差异主要分为上皮标志物阳性表型(简称上皮细胞型)、间质标志物阳性表型(简称间质细胞型)和上皮与间质混合表型(简称上皮-间质细胞型)等。上皮细胞型CTCs通过发生上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)增加迁移和侵袭能力，到达潜在的转移位点，在合适的微环境下可形成新的肿瘤灶。因此，对肿瘤患者血液中的CTCs进行检测和分型鉴定对疾病的早期诊断、疗效评估、个体化治疗方案的建立和预后评估具有重要意义。

CTCs在人体血细胞中的含量很少，1mL血中仅含有约1-10个CTCs，因此，对其检测和分型鉴定技术必须要具备极高的灵敏度和特异性。目前通过表面蛋白质的表达对CTCs进行检测主要依赖于上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)，由于处于不同的阶段CTCs抗原表达具有差异，所以造成了丢失EpCAM表达的CTCs无法被检测。且传统的蛋白质检测技术，如免疫荧光染色、流式细胞术和免疫染色法等具有操作过于繁琐、样品消耗量大以及不能自动化等缺陷，无法实现CTCs的高效、精准的自动化检测。

微流控技术是指在可在微纳米尺度范围内集成物理、化学及生物手段，实现整体器件的微型化和低成本检测系统，为CTCs的高灵敏度、高效分选提供重要的潜在技术方法。国内外均有商品化的基于微流控技术的CTCs检测鉴定方法和试剂盒上市，包括CellSearch检测系统、微流控多色荧光细胞计数仪、循环肿瘤细胞检测系统和循环肿瘤细胞捕获仪及其捕获染色方法等。目前的微流控技术主要基于CTCs的物理性质(细胞大小和变形性差异等)和抗原表达差异来进行捕获和鉴定。由于使用的捕获抗体较单一，大多基于上皮细胞标志物，造成了一定程度的漏检，降低了检测的灵敏度和准确性。为了对捕获的CTCs进行分子和蛋白质分析，需要将其与特异性结合物分离。传统的分离方法具有回收率低、损伤细胞活性、完整性和表面抗原等缺陷，影响了后续的分型鉴定。因此，急需一种灵敏度高、精确度高、特异性强的高效自动化CTCs分型检测方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种基于微流控技术的CTC蛋白质分型试剂盒，能通过从生物样本中高效捕获、分离和检测CTCs蛋白质是否存在，实现对CTCs进行分型鉴定。

实现上述目的的技术方案如下。

一种基于微流控技术的CTC蛋白质分型试剂盒，包括有：

(1)针对不同CTCs标志蛋白质的捕获抗体复合物：每种捕获抗体复合物由与对应的标志蛋白质特异性结合的捕获抗体和适配体通过可剪切材料连接而成，所述可剪切材料为具有2个或2个以上的限制性内切酶位点的回文结构的脱氧核糖核苷酸双链；所述适配体能与相应的特异性结合物结合，