[发明专利]一种快速区分乳酸菌菌种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地涉及一种快速区分乳酸菌菌种的方 法。

背景技术

乳酸(Lacticacid)是一种天然存在的有机酸。由于其分子内含有一个 不对称的碳原子，所以具有D-和L-两种构型。D-乳酸为右旋；L-乳酸为左 旋；当D-乳酸和L-乳酸等比例混合时，即为消旋的DL-乳酸。

通常，乳酸菌可以合成D-型、或L-型或DL-型的乳酸，依菌种不同而 异。对于菌落形态相似的乳酸菌，由于培养过程中难以区分，增加了菌种污 染的不确定性。菌种鉴定的常用手段一般是挑选单克隆进行培养后，抽提基 因组进行16SrDNA序列的扩增，然后进行测序，根据测序结果进行同源 BLAST，整个流程通常需要3～4天才能完成。而常规的乳酸菌菌种鉴定试剂 盒，如鉴定乳酸菌的API50试剂盒，由于含有49种碳源，一一比对，有时 也无法得到准确的结果，且该试剂盒价格十分昂贵，不适合推广使用。因此， 对于菌落和显微形态均较为相似的菌种需要一种更为简便的方法，以达到准 确区分菌种的目的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中鉴定菌种的16SrDNA 测序法耗时长而现有的乳酸菌菌种鉴定试剂盒API50试剂盒区分乳酸菌菌 种操作繁琐、价格昂贵、检测结果不稳定的技术问题，提供了一种快速区分 乳酸菌菌种的方法。本发明的方法无需提取待检菌种的基因组进行16srDNA 的扩增，能够准确、快速、简便地区分菌落形态和显微形态相似的乳酸菌菌 种。

本发明提供以下技术方案解决上述技术问题：

本发明技术方案之一：一种快速区分乳酸菌菌种的方法，所述方法包括 以下步骤：

(1)将待检乳酸菌菌种的培养液离心，取上清稀释20-25倍，得稀释培 养液上清；

(2)用D-乳酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶按如下表1所示体系分别与步骤 (1)所述稀释培养液上清进行反应：

表1乳酸测定的反应体系

其中，所述稀释培养液上清、水、双甘氨肽缓冲液、NAD+与D-谷氨酸 -丙酮酸转氨酶在加入D或L-乳酸脱氢酶前混合，混合时间2-4min，然后读 取溶液吸光值A1，然后加入D-乳酸脱氢酶或L-乳酸脱氢酶反应，反应时间 为4-6min，然后读取溶液吸光值A2；

(3)分别计算步骤(2)中所述对照和所述样品的吸光值变化值(A2-A1)， 将所述样品的吸光值变化值减去所述对照的吸光值变化值得ΔA_D-乳酸或ΔA_L-乳酸；将所得ΔA_D-乳酸或ΔA_L-乳酸代入以下公式，计算得到步骤(1)所述待检乳 酸菌菌种的D-乳酸或L-乳酸浓度：

其中，V为终体积，单位为mL；MW为乳酸的分子量，单位为g/mol； ε为340nmNADP的消光系数；d为光路，单位为cm；v为样品体积，单位 为mL；根据得到的所述待检乳酸菌菌种的D-乳酸和L-乳酸的浓度的比值对 所述待检乳酸菌菌种进行区分。

本发明步骤(1)中，所述待检乳酸菌菌种的培养液可以通过本领域常 规的方法获得，例如通过在培养基中培养获得。所述培养基可以为本领域常 规的用于培养乳酸菌的培养基，较佳地为MRS液体培养基。所述培养的条 件可以为本领域常规的培养乳酸菌的条件，所述培养的温度可以为本领域常 规的温度，较佳地为37℃。所述培养的时间可以为本领域常规的时长，较佳 地为36-48h，更佳地为48h。所述培养的方法可以为本领域常规的方法，较 佳地为静置培养。取上清稀释20-25倍，较佳地为取上清稀释20倍。

本发明步骤(2)中，所述双甘氨肽缓冲液可以为本领域常规的缓冲液， 即甘氨酰甘氨酸缓冲液。所述双甘氨肽缓冲液的浓度可以为本领域常规的浓 度，较佳地为0.5mol/L。所述双甘氨肽缓冲液的pH值可以为本领域常规的 pH值，较佳地为8.9。所述混合时间为2-4min，较佳地为2min，所述反应 时间为4-6min，较佳地为5min。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发 明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。