[发明专利]黄曲霉毒素B1的检测方法及检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种检测黄曲霉毒素B1的方法及试剂盒，该方法包括如下步骤：（A）使黄曲霉毒素B1核酸适体Apt与单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链；（B）使该杂交链与待测样品接触，当待测样品中有黄曲霉毒素B1存在时，杂交链与黄曲霉毒素B1反应释放出ssDNA；（C）利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸而除去双链DNA，此时体系中留下ssDNA；（D）在ssDNA诱导下，银离子还原生成近红外荧光银纳米簇；检测体系荧光强度，从而测定待测样品中的黄曲霉毒素B1的含量。该方法具有高灵敏度，操作简单，低成本等特点。

技术领域

本发明涉及纳米生物传感以及生物检测领域，具体地说，是提供一种黄曲霉毒素B1的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

黄曲霉毒素B1对包括人和若干动物具有强烈的毒性，是已知的化学物质中致癌性最强的一种，对人畜危害极大。黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉等产生的代谢产物。黄曲霉毒素广泛存在于土壤、大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶及其制品、食用油、肉类（鱼）制品、花生和核桃中等动植物和各种坚果中，特别是花生和核桃中。当人摄入含黄曲霉毒素B1污染的食物，可发生急性肝炎、出血性坏死等急性中毒，甚至死亡；当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，致癌、致畸等。黄曲霉毒素在农产品中几乎无法避免，在天然食物中以黄曲霉毒素B1最为多见，危害性最强，国家质检总局规定黄曲霉毒素B1是大部分食品的必检项目之一。我国食品卫生标准中规定：玉米、花生油、花生及其制品中黄曲霉毒素不得>20μg / kg；大米、其它食用油不得>10μg / kg；其它粮食、豆类、发酵食品不得>5μg / kg；婴儿代乳食品不得检出黄曲霉毒素。欧盟等国于2002年对粮食，花生及其产品中的黄曲霉毒素B1含量规定，人类直接使用的花生中黄曲霉毒素B1含量需≤2μg/kg，作为食品原料进口的花生黄曲霉毒素B1含量需≤8μg/kg。人们若食品中黄曲霉毒素含量超出一定标准，就会直接威胁到人的健康。因此，建立高选择性、高灵敏的黄曲霉毒素B1的检测方法非常有价值。

目前国内外研究主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、免疫亲和柱法以及酶联免疫法等。TLC 法的特异性较差，灵敏度也相对较差，所需标准品浓度较高，潜在的污染性较高。HPLC 法需要具有专门操作技术的人员才能进行检测，技术要求高；净化柱消耗较多，检测成本较高，免疫亲和柱特异性较好，但仍然需要专门技术人员才能胜任检测工作，检测技术要求高。免疫法具有操作简便、快捷、污染较小、灵敏度也较高等许多优势，但通常需要用到价格昂贵的酶标试剂、酶、抗原、抗体等生物试剂，而且这些生物试剂也很易失活。

发明内容

本发明提供一种检黄曲霉毒素B1的方法，该方法包括如下步骤：

（A）黄曲霉毒素B1核酸适体Apt与单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链；

（B）将待测样品溶液加入到该杂交链溶液，当待测样品中有黄曲霉毒素B1时，杂交链选择性地与黄曲霉毒素B1反应释放出单链信号探针ssDNA；

（C）消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用核酸外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸而除去双链DNA，留下单链信号探针ssDNA；

（D）利用黄曲霉毒素B1核酸适体-黄曲霉毒素结合体不能诱导银离子还原成近红外荧光的银纳米簇，只有单链信号探针ssDNA能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇，在银离子还原检测体系中检测体系荧光强度，从而测定待测样品中的黄曲霉毒素B1的含量。

所述银离子还原检测体系包括先后添加的银离子和使银离子还原成近红外荧光银纳米簇的硼氢化物还原剂，例如硼氢化钠。步骤（D）的检测，例如包括依次先后向体系中加入银离子溶液和硼氢化钠溶液，反应后生成近红外荧光银纳米簇。