[发明专利]一种预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗，其特征在于，其组分包括H9N2型流感病毒样颗粒；其中，所述H9N2型病毒样颗粒为H9N2型流感病毒的病毒样空壳颗粒结构，所述空壳颗粒结构的囊膜表面含有H9N2型流感病毒的结构蛋白；

所述结构蛋白为H9N2型流感病毒的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和基质蛋白M1；其中，所述HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述HA蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述NA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述NA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述M1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述M1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述疫苗的组分还包括佐剂；所述佐剂为微球佐剂；

所述微球佐剂采用如下方法制备：

1）将乙酸、吐温-80、水和壳聚糖混合均匀，配制成混合溶液，所述混合溶液中壳聚糖的质量浓度为0.25%~0.3%、乙酸的质量浓度为2%~2.5%、吐温-80的质量浓度为1%~1.2%；

2）在磁力搅拌和超声作用下，将质量浓度为10%~15%的Na₂SO₄溶液以1~1.2 mL/min的速度滴入步骤1）配制的混合溶液中，持续磁力搅拌和超声作用20~25min后，以2750~3500r/min离心20~30min，用超纯水清洗离心沉淀物，以2750~3500r/min离心20~30min，再次重复两次洗涤离心后，将沉淀物冷冻干燥，得到微球佐剂；其中，所述Na₂SO₄溶液与所述混合溶液的体积比为1:100~120。

2.一种如权利要求1所述预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）根据权利要求1所述SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，合成HA、NA和M1基因，并设计合成HA、NA和M1基因的引物，供检测之用；其中，HA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，HA基因的下游引物序列如SEQ ID NO.8所示，NA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，NA基因的下游引物序列如SEQ ID NO.10所示，M1基因的上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，M1基因的下游引物序列如SEQ ID NO.12所示；

2）用限制性内切酶BamHI和NotI对昆虫杆状病毒表达载体pFastBac-DuaL和合成的M1基因进行酶切并连接过夜后，转化入感受态细胞进行培养，抽提阳性克隆的重组质粒DNA，得到重组质粒pFastBac-DuaL-M1；所述感受态细胞为DH5a感受态细胞；

3）用限制性内切酶SmaI和NheI酶对步骤2）得到的重组质粒pFastBac-DuaL-M1和合成的HA基因进行酶切并连接过夜后，转化入感受态细胞进行培养，抽提阳性克隆的重组质粒DNA，得到重组质粒pFastBac-DuaL-HA-M1；

4）用限制性内切酶SmaI和NheI酶对步骤3）得到的重组质粒pFastBac-DuaL-HA-M1和合成的NA基因进行酶切并连接过夜后，转化入感受态细胞进行培养，抽提阳性克隆的重组质粒DNA，得到重组质粒pFastBac-DuaL-HA-NA-M1；

5）将步骤4）得到的重组质粒pFastBac-DuaL-HA-NA-M1转导入E.coLi感受态细胞株DH10Bac细胞中，并经过蓝白筛选，挑取白色菌落，并提取质粒，得到质粒rBacmid-HA-NA-M1；

6）将步骤5）得到的质粒rBacmid-HA-NA-M1转染SF9昆虫细胞，得到重组杆状病毒；

7）将步骤6）得到的重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞，培养后收集上清液，并对上清液进行纯化，得到H9N2型流感病毒样颗粒；

8）将佐剂溶于步骤7）得到的所述H9N2型流感病毒样颗粒中，于37℃下孵育3h后，离心弃去上清液，对沉淀进行清洗，即得到所述预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗。

3.根据权利要求2所述预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤3）和步骤4）中所述感受态细胞均为E.coLiDH5a感受态细胞。