[发明专利]一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法

说明书

本发明涉及一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法。该方法是通过基因合成方法制备SSD609多肽毒素的DNA序列，用PCR方法在其前面插入Factor‑Xa酶切位点，并克隆至带有His₆亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上。将质粒转化进入大肠杆菌，异丙基硫代半乳糖苷诱导高效表达。细菌破碎后使用镍柱进行纯化，并用Factor‑Xa酶切断His₆‑SUMO融合标签和SSD609，反挂镍柱除去His₆‑SUMO。SSD609用HPLC进一步纯化后，加入一定比例的GSH和GSSG，使SSD609中二硫键重新连接成热力学稳定的状态，构象变得均一。再次用HPLC纯化SSD609，冻干后备用。本发明所提供的制备SSD609方法操作简便，产量多，纯度高，成本较低，且拥有类似天然状态下SSD609的生理功能，可用于该蜈蚣毒素的大量制备。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法。

背景技术

最近在一种蜈蚣亚型Scolopendra subspinipes dehaani的毒液组学和转录组学的研究中发现了许多多肽毒素，其中一些对离子通道有调节作用。他们用3V的电压刺激这种蜈蚣的毒腺，然后用微小的吸管收集毒液。将毒液稀释在Tris-HCl(20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 7.6)溶液中之后，离心取上清，冻干(300mg冻干的蜈蚣粗毒需要大约400只蜈蚣，即平均从一只蜈蚣中提取的毒素不到1mg，量非常微小)。然后将300mg蜈蚣粗毒溶于3mL Tris-HCl溶液中，用凝胶过滤层析的方法分离。收集分离出来的每一个峰，继续用阴离子交换层析和反相高效液相色谱C18柱分离，进一步纯化，从而分离出许多毒液中单一的组分。SSD609是其中之一，能够可逆地抑制KCNQ1/KCNE1钾离子通道电流，拥有潜在的药物治疗可能性(Peng,K.,Kong,Y.,Zhai,L.,et al.Two novel antimicrobial peptides fromcentipede venoms[J].Toxicon:official journal of the International Society onToxinology,55(2-3):274-279.)。但是这种方法得到的蜈蚣毒素SSD609的量非常微小，本发明提供的利用大肠杆菌异源表达纯化的方法，操作简便、成本低，能够大量制备出拥有生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法，该方法操作简便，产量多，纯度高，成本低，且拥有类似天然状态下SSD609的生理功能，可用于该蜈蚣毒素的大量制备。

实现本发明目的的制备流程图如图1所示，具体技术方案如下：

(1)获取SSD609蛋白的DNA序列，所述DNA序列如SEQ ID No.1所示；

(2)将SSD609的DNA序列连接到带有His₆亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上，构建pET28-His₆-SUMO-Factor Xa-SSD609质粒；

(3)将pET28-His₆-SUMO-Factor Xa-SSD609质粒转化进入大肠杆菌，培养后采用异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thio-galactoside，IPTG)诱导表达，离心后收菌；

(4)将细菌悬液超声破碎后离心取上清液，用镍柱纯化，洗脱后得到His₆-SUMO-SSD609融合蛋白；