[发明专利]一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法

权利要求书

1.一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法，包括如下步骤：

（1）获取SSD609蛋白的DNA序列，所述DNA序列如SEQ ID No.1所示；

（2）将SSD609的DNA序列连接到带有His₆亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上，构建pET28-His₆-SUMO-Factor Xa-SSD609质粒；

（3）将pET28-His₆-SUMO-Factor Xa-SSD609质粒转化进入大肠杆菌，培养后采用异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thio-galactoside，IPTG)诱导表达，离心后收菌；

（4）将细菌悬液超声破碎后离心取上清液，用镍柱纯化，洗脱后得到纯化的His₆-SUMO-SSD609融合蛋白；

（5）His₆-SUMO- SSD609融合蛋白用Factor Xa酶进行酶切，得到含有His₆-SUMO标签和SSD609多肽毒素的蛋白混合液；将该混合液与镍柱混合，His₆-SUMO标签与镍柱结合，而SSD609多肽毒素则作为流穿液被收集，并用HPLC进一步纯化；

（6）经HPLC纯化后的SSD609多肽毒素使用还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽进行二硫键重建，获得状态均一的SSD609多肽毒素；

（7）再次使用HPLC对SSD609多肽毒素进行纯化，并质谱验证SSD609的分子量大小，冻干备用。

2.根据权利要求1所述的一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法，其特征在于，所述步骤（3）中蛋白表达的具体方法如下：

将pET28-His₆-SUMO-Factor Xa-SSD609质粒转化进入Escherichia coli BL21(DE3)gold细胞中，37 ℃ 培养箱中生长24 h；挑选单克隆，在4 mL LB小管中扩增后加入到600mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液态培养基中，37℃ 培养，转速为225 rpm；当菌液OD600达到0.8时加入终浓度为0.5 mM IPTG进行诱导，融合蛋白开始表达，于25 ℃ 培养箱中培养；20h后离心机离心收菌，4000 rpm离心20 min，弃上清液；用35 mL裂解液重悬底部的E.coli细胞，收集细菌悬液，备用。

3.根据权利要求1所述的一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法，其特征在于，所述步骤（4）中蛋白纯化的具体方法如下：

将细菌悬液用超声破碎仪破碎，离心后取上清，得到含有杂蛋白的蛋白混合液；Ni²⁺-NTA胶先用ddH₂O冲洗，再用Binding buffer平衡；平衡后的Ni²⁺-NTA胶与蛋白混合液混合，使His₆-SUMO-SSD609蛋白与Ni²⁺-NTA胶结合；将结合了蛋白的Ni²⁺-NTA胶加入重力流穿柱，用含30 mM咪唑的Binding buffer洗去非特异性结合的杂蛋白，再用含有300 mM咪唑的Binding buffer洗脱His₆-SUMO-SSD609融合蛋白。