[发明专利]一种重组腺相关病毒的制备方法

说明书

本发明公开了一种重组腺相关病毒(rAAV)的制备方法，包括以下步骤：(1)将目标基因构建在重组型杆状病毒上，所述重组杆状病毒其基因组整合了制备rAAV所必需的腺相关病毒的Rep基因、Cap基因以及携带有目标基因的ITR核心表达元件；(2)将步骤(1)中制得的重组杆状病毒感染宿主昆虫幼虫，使得所述宿主昆虫幼虫体内产生大量rAAV；(3)将步骤(2)中获得的宿主昆虫幼虫裂解，提取rAAV并进行纯化。本发明提供的方法，通过一种高度整合的重组杆状病毒感染昆虫幼虫，从而大量制备品质稳定的基因治疗用rAAV载体。

技术领域

本发明属于基因治疗领域，更具体地，涉及一种重组腺相关病毒的制备方法。

背景技术

重组腺相关病毒(rAAV)具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、能介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点，是基因治疗领域最具应用前景的载体之一。rAAV在神经科学研究以及疾病的基因治疗等领域具有重要作用和巨大需求。有研究数据表明，一次大型灵长类动物试验或临床基因治疗试验就需要约10¹⁵VG(VG，virus genomes)的rAAV，是一般体外细胞试验或小鼠试验用量的成百上千倍(Hum Gene Ther.2002Nov 1；13(16):1935-43.)。

杆状病毒(baculovirus)属于杆状病毒科，专一性寄生于节肢动物体内，多见于昆虫纲的鳞翅目昆虫，可感染600多种昆虫。杆状病毒是有囊膜的双链环状DNA病毒，其基因组大小在90kb-230kb之间，编码上百种蛋白。1983年，smith首次利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa Californica Multicapsid Nuclear Polyhedrosis Virus，AcMNPV)在草地贪夜蛾细胞系Sf9中成功表达了人β-干扰素，首创了杆状病毒表达系统(Mol CellBiol,1983,3:2156-2165)。1985年，Maeda用家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori NuclearPolyhydrosis Virus，BmNPV)作为表达载体，在家蚕体内表达了人α-干扰素(Nature,1985,315:592-594)。此后，杆状病毒表达系统不断完善和发展，已经成为应用非常广泛的一种真核表达系统。昆虫是一类与腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)同属于微小病毒科(parvoviridae)的浓核病毒亚科(Densovirinae)病毒的自然宿主。2002年，Urabe等人证实了感染杆状病毒的Sf9昆虫细胞可以支持AAV的复制，利用分别携带有AAV的Rep基因、Cap基因以及ITR核心表达元件的三种重组杆状病毒共同感染Sf9细胞制备出了rAAV，成功建立了三杆状病毒系统(Three Bac system),(Hum Gene Ther.2002Nov 1；13(16):1935-43.)。在此基础上，研究者相继开发出了更适合大规模制备rAAV的两杆状病毒系统(Two Bacsystem),(Mol Ther.2008May；16(5):924-30，Mol Ther.2009 Nov；17(11):1888-96.)以及依赖感染诱导表达Rep基因和Cap基因的包装细胞系的一杆状病毒系统(One Bac system),(Proc Natl Acad Sci USA.2009 Mar 31；106(13):5059-64，Hum Gene Ther.2014Mar；25(3):212-22.)。

目前利用杆状病毒系统大规模制备rAAV的方法，都是依靠重组杆状病毒感染体外培养的特定的昆虫细胞系，如Sf9、Sf21细胞等。然而体外细胞系培养工艺复杂，设备条件要求苛刻、生产成本高昂。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种重组腺相关病毒的制备方法，其目的在于利用一种重组杆状病毒感染昆虫幼虫大规模生产重组腺相关病毒，由此解决现有的重组腺相关病毒生产方法工艺复杂、条件要求苛刻、生产成本高昂的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：