[发明专利]一种重组腺相关病毒的制备方法

权利要求书

1.一种重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将目标基因构建在重组杆状病毒上，所述重组杆状病毒其基因组整合了制备重组腺相关病毒所必需的腺相关病毒的Rep基因、Cap基因以及携带有目标基因的ITR核心表达元件；所述ITR核心表达元件通过5’端连接核酸片段和3’端连接核酸片段与所述Rep基因和Cap基因的表达框相连；所述核酸片段为长度在80bp-140bp之间的连接核酸序列；

(2)将步骤(1)中制得的重组杆状病毒感染宿主昆虫幼虫，使得所述宿主昆虫幼虫体内产生大量重组腺相关病毒；

(3)将步骤(2)中获得的宿主昆虫幼虫裂解，提取重组腺相关病毒并进行纯化。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体包括以下步骤：

(2-1-1)将孵化后的宿主昆虫幼虫饲养至幼虫长到4-5龄；

(2-1-2)将步骤(1)中制得的重组杆状病毒，对(2-1-1)中获得的宿主昆虫幼虫进行皮下注射接毒，滴度在1×10E+7 VG/ml至1×10E+9 VG/ml，接毒体积在10μL-20μL；

(2-1-3)将步骤(2-1-2)中注射了重组杆状病毒的宿主昆虫幼虫饲养至幼虫出现食欲减弱、行动迟缓、体节肿胀和/或体色变淡的病变症状时，结束饲养收获虫体。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2-1-3)在注射所述重组杆状病毒后3至7天结束饲养。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组杆状病毒为基于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒或家蚕核型多角体病毒。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述宿主昆虫幼虫为甜菜夜蛾幼虫或家蚕幼虫。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)将所述宿主昆虫幼虫裂解，其具体操作步骤如下：

将所述宿主昆虫幼虫捣碎研磨，加入PBS溶液匀浆，冻融后，制得裂解物。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述纯化，具体操作如下：

将所述宿主昆虫幼虫裂解后，将裂解物离心，取上清液，用氯仿抽提，获得初步纯化的重组腺相关病毒。