[发明专利]一种基于纳米探针C60的癌胚抗原的电化学免疫传感器的构建方法

权利要求书

1.一种基于纳米探针C₆₀的癌胚抗原(CEA)的电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)用Al₂O₃抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干；以10mL含有浓度为1.0mmoL/L的HAuCl₄溶液为底液，以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极在-0.8～0.6V电位范围内进行循环伏安扫描30圈后，将电极在0.1moL/L的KCl溶液中浸泡过夜，用PBS(pH7.4)缓冲液冲洗得到金纳米簇修饰玻碳电极(nano-Au/GCE)；

(2)取10μL1~2.5μg/mL的CEA第一抗体(Ab₁)标准溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到Ab₁/nano-Au/GCE；

(3)取10μL质量分数为1~3%的BSA溶液滴涂到Ab₁/nano-Au/GCE表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab₁/nano-Au/GCE；

(4)将10μL0.1pg/mL~1.0ng/mL的一系列不同浓度的CEA标准溶液滴涂到BSA/Ab₁/nano-Au/GCE表面用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到CEA/BSA/Ab₁/nano-Au/GCE；

(5)滴加6~10μLAuNPsL-cys-C₆₀标记CEA第二抗体(Ab₂-AuNPsL-cys-C₆₀)到上述电极表面，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，再取10μL10mmoL的四辛基溴化铵甲苯溶液滴涂到电极表面室温下孵育10min后用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于纳米探针C₆₀的CEA的电化学免疫传感器(Ab₂-AuNPsL-cys-C₆₀/CEA/BSA/Ab₁/nano-Au/GCE)。

2.根据权利要求1所述的一种基于纳米探针C₆₀的CEA的电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于所述步骤(5)中Ab₂-AuNPsL-cys-C₆₀的具体制作步骤为：

(1)AuNPsL-cys-C₆₀的制备

在磁力搅拌下，将0.40g的L-cys加入到1.0mL7.1moL/L的NaOH溶液中，然后加入8mL乙醇继续搅拌使得溶液充分混匀，将2mL1mg/mL的C₆₀的甲苯溶液加入到上述混合溶液中，在室温下持续搅拌24h，用超纯水离心洗涤3次得到L-cys-C₆₀；将L-cys-C₆₀重新分散到4mL超纯水中，取2mL0.01mol/L的HAuCl₄加入到上述溶液中搅拌24h，之后滴加0.03mol/L的抗坏血酸直至溶液成黑色，用超纯水离心洗涤得到AuNPsL-cys-C₆₀，将AuNPsL-cys-C₆₀重新分散到2mL超纯水中；

(2)Ab₂-AuNPsL-cys-C₆₀的制备

取0.2mL10μg/mL的Ab₂在搅拌的条件下加入到2mLAuNPsL-cys-C₆₀溶液中，室温下搅拌30min后在4℃下孵育过夜，得到的混合溶液在9000r/s离心15min，弃去上清液，重新溶解到1mLPBS(pH7.4)缓冲溶液中，得到Ab₂-AuNPsL-cys-C₆₀溶液。

3.根据权利要求1所述的制备方法制备的一种基于纳米探针C₆₀的CEA的电化学免疫传感器的构建方法，其特征在于，用于CEA的检测，检测步骤如下：

(1)实验在电化学工作站上进行，采用三电极体系以所制备的免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，在PBS(pH7.4)缓冲溶液中进行测试；

(2)用差分脉冲伏安法对一系列不同浓度CEA标准溶液及未特异性结合CEA的电极进行检测，扫描的电位区间为-0.4V~0.4V，扫描速度为100mV/s，记录示差脉冲伏安图，根据所得的峰电流值和CEA浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线；

(3)将待测样品溶液代替CEA标准溶液进行检测。