[发明专利]一种用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制 剂及其制备方法。

背景技术

肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌 的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养 和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目 的，实验及临床均提示机体的免疫系统具有清除癌症的作用，在原发性癌症手术切除或经氩 氟刀等微创手术消融掉局部癌症后，用免疫疗法能杀灭剩余的癌症细胞，消除复发、转移的 因素，增大治愈的可能性，延长生存时间，提高生活质量。肿瘤细胞免疫疗法已经成为继手 术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。

NKT(naturalkillerT)细胞是一群细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的 特殊T细胞亚群，NKT细胞具有免疫调节作用和细胞毒作用，是能用于杀伤肿瘤的免疫细胞 之一。NKT细胞受到刺激后，可以分泌大量的IL-4，IFN-γ，GM-CSF，IL-13和其它细胞因 子和趋化因子，发挥免疫调节作用，NKT细胞是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。NKT 细胞活化后具有NK细胞样细胞毒活性，可溶解NK细胞敏感的靶细胞，主要效应分子为穿 孔素、Fas配体以及IFN-γ，故增强NKT细胞的扩增效果和细胞毒作用具有很大的意义。现 有技术中主要采用IL-2来促使NKT细胞的增殖，扩增效果不显著，且杀伤活性相对较差。

NKT细胞制剂：在GMP实验室条件下，分离出单个核细胞，并诱导培养成NKT细胞， 收集NKT细胞，保存在含有一定浓度的HSA的溶液中，即为NKT细胞制剂。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制 剂，具有很高的杀伤活性，应用于免疫疗法能够有效杀灭剩余癌症细胞，消除复发、转移的 因素，增大治愈的可能性，延长患者生存时间，提高生活质量。

本发明的另一目的是提供一种用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制剂的制备方法， 采用IL-2、IL-15和IL-21联合培养NKT细胞，并且采用肿瘤细胞和刺激因子来致敏NKT细 胞，使NKT细胞的扩增效果得到增强，且其杀伤活性也大大增强。

本发明通过以下技术方案实现该目的：

一种用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制剂，由经过肿瘤细胞和刺激因子致敏的 NKT细胞和生理盐水组成。

作为优选的，所述生理盐水中含有1～5％的人血白蛋白。

作为优选的，所述NKT细胞与生理盐水的体积比为1:2。

一种用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)采集患者自身外周血20mL，离心后收集血浆；

2)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有Ficoll分离液的sepmate离 心管中，300～500g离心10-20min，血细胞与生理盐水的体积比为1:2～2:1；

3)将步骤2)中离心后的上层液体从离心管中倒出，再加入15～25mL的RPMI1640培 养基重悬细胞，300～500g离心10-20min；

4)加入X-VIVO-15培养基进行培养，细胞密度为5～10×10⁵/mL；同时向培养基中加入 100-1000U/mL的IL-15、100-1000U/mL的IL-21、50-500μg/mL的OKT-3、100-1000U/mL 的IL-2，每日观察NKT细胞的形态；

5)在培养的第6天向培养基中添加50μg/mL的CEA或PSA，对NKT细胞进行刺激培 养；

6)在培养的第9天向培养基中添加50～200μg/mL的TNF-α，对NKT细胞进行致敏 培养；

7)培养14天后收集NKT细胞，将NKT细胞保存在含有1～5％的人血白蛋白的生理盐 水溶液中，制得用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制剂。

其中，在培养过程中每隔两日计数细胞一次，并补加一定量的X-VIVO-15培养基、IL-15、 IL-21、OKT-3、IL-2。