[发明专利]一种用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制剂及其制备方法

权利要求书

1.一种用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制剂，由经过肿瘤细胞和刺激因子致敏 的NKT细胞和生理盐水组成。

2.如权利要求1所述的用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制剂，所述生理盐水中 含有1～5％的人血白蛋白。

3.如权利要求1所述的用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制剂，所述NKT细胞与 生理盐水的体积比为1:2。

4.一种用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)采集患者自身外周血20mL，离心后收集血浆；

2)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有Ficoll分离液的sepmate离 心管中，300～500g离心10-20min，血细胞与生理盐水的体积比为1:2～2:1；

3)将步骤2)中离心后的上层液体从离心管中倒出，再加入15～25mL的RPMI1640培 养基重悬细胞，300～500g离心10-20min；

4)加入X-VIVO-15培养基进行培养，细胞密度为5～10×10⁵/mL；同时向培养基中加入 100-1000U/mL的IL-15、100-1000U/mL的IL-21、50-500μg/mL的OKT-3、100-1000U/mL 的IL-2，每日观察NKT细胞的形态；

5)在培养的第6天向培养基中添加50μg/mL的CEA或PSA，对NKT细胞进行刺激培 养；

6)在培养的第9天向培养基中添加50～200μg/mL的TNF-α，对NKT细胞进行致敏 培养；

7)培养14天后收集NKT细胞，将NKT细胞保存在含有1～5％的人血白蛋白的生理盐 水溶液中，制得用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制剂。

5.如权利要求4所述的用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制剂的制备方法，在培 养过程中每隔两日计数细胞一次，并补加一定量的X-VIVO-15培养基、IL-15、IL-21、OKT-3、 IL-2。

6.如权利要求4所述的用肿瘤细胞和刺激因子致敏的NKT细胞制剂的制备方法，在培 养14天后，抽取1×10⁶的NKT细胞进行流式检测，分别抽取8×10⁶的NKT细胞对SW620 和PC-3进行杀伤活性检测。