[发明专利]使用基因组编辑技术CRISPR-Cas9诱导CCR5Δ32缺失的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种新的基因组编辑技术CRISPR-Cas9诱导CCR5 Δ32缺失的方法。

背景技术

由人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)或称艾滋病病毒引 起的艾滋病(AcquiredImmuneDeficiencySyndrome，AIDS)在全球已经流行了30多年。艾 滋病属于烈性传染病，HIV病毒可以直接攻击人体免疫系统，导致人体免疫机能缺陷，最终 因各种机会性感染和肿瘤导致患者死亡。HIV主要分成2个型，HIV-1和HIV-2型。在全球引起 艾滋病的主要是HIV-1，HIV-2仅限于非洲部分地区和其他地区的散在报道。据世界卫生组 织(WorldHealthOrganization，WHO)报道，截止2013年底，全世界约有3500万HIV-1存活 感染者，另有大约3000万人已经死亡，总计大约6500万人。2013年新发HIV-1感染者约为210 万，当年死于艾滋病的病人约为150万(http://www.who.int)。迄今为止，依然没有有效的 抗艾滋病疫苗。虽然抗逆转录病毒药物以及抗病毒疗法(antiretroviraltherapy，ART)已 经取得很大的进展，能够有效控制病毒的复制，但依然不能彻底清除病人体内的HIV病毒， 不能从根本上治愈艾滋病,并且由于抗逆转录疗法所需周期长,给病人家庭也带来了巨大 的精神压力和经济压力。

我国也同样经历了艾滋病的打击。早在1989年，一例血友病患者因输血感染艾滋 病。九十年代，云南吸毒人群艾滋病爆发流行。进入二十一世纪，我国艾滋病的流行逐渐从 采供血人群、吸毒人群向性传播人群转变，包括同性恋和异性恋传播。据中国卫生部和联合 国艾滋病规划署报道，截至2011年底，估计中国存活HIV-1感染者和艾滋病病人78万人(62 ～94万人)，女性占28.6％；艾滋病(AIDS)病人15.4万人(14.6～16.2万人)；全人群感染率 为0.058％(0.046％～0.070％)。估计2011年当年新发HIV-1感染者4.8万人(4.1～5.4万 人)，2011年艾滋病相关死亡2.8万人(2.5～3.1万人)。同样，中国的艾滋病流行情况也不容 乐观。

HIV病毒主要攻击人的免疫系统，首先通过识别并结合细胞表面的CD4受体(CD是 (ClusterofDifferentiation的缩写)是位于细胞膜表面一类分化抗原的总称，CD后的序 号代表一个或一类分化抗原分子)。CD4是HIV感染所必须的，在后续过程中HIV病毒分子还 需要与辅助受体相互作用，辅助受体主要为趋化因子受体CCR5(C-CChemokinereceptor type5)和CXCR4(C-X-Cchemokinereceptortype4)受体。HIV病毒成功结合受体蛋白和 辅助受体蛋白后，导致病毒的包膜和细胞膜结构发生改变，从而发生融合，病毒进入细胞内 部。CCR5是一个7次跨膜蛋白(如图1)，含有352个氨基酸，是细胞表面的一种正常的趋化因 子受体，同时也是HIV进入靶细胞CD4阳性细胞的主要辅助受体。人们发现，在欧洲高加索人 中存在着一些可以抵抗HIV病毒的人，测序表明，在这些人中正常的CCR5基因突变成了CCR5 Δ32基因。CCR5Δ32缺失为CCR5基因编码区第794-825位的32个碱基的缺失(如图2)，使其 185位后的氨基酸发生改变，导致翻译提前终止，产生了一种仅有215个氨基酸的缺失蛋白， 这种缺失蛋白由于丧失了5、6、7三个跨膜区域，不能正常定位于细胞膜上，只能停留在内质 网中。拥有这种突变的细胞由于缺少了能与病毒融合所需要的辅助受体，使其具有了能够 抵抗HIV的能力。若细胞内的CCR5双等位基因都带有Δ32缺失，则该细胞为纯合子，记作 CCR5Δ32/Δ32；若仅有一个Δ32缺失突变，另一个为野生型，则为杂合子，记作CCR5Δ32/ WT。研究表明，CCR5Δ32/Δ32纯合子缺失对HIV具有天然抗性，不能感染HIV病毒；CCR5Δ 32/WT杂合子缺失，可以延长艾滋病的发病期。