[发明专利]使用基因组编辑技术CRISPR-Cas9诱导CCR5Δ32缺失的方法

权利要求书

1.使用基因组编辑技术CRISPR-Cas9诱导CCR5Δ32缺失的方法，其特征在于使用了基 因组编辑技术——成簇的、规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白CRISPR-Cas9技术，成 功诱导了CCR5Δ32缺失，该方法的具体内容包括：

第一、引导RNA(gRNA)的设计

为达到获得CCR5Δ32/Δ32纯合子细胞的目的，针对于CCR5Δ32两侧的目标序列设计 一对gRNA，左侧的目标序列为gRNA对应的DNA序列SEQIDNo.1或者SEQIDNo.3-19中的任 一个序列，右侧的目标序列为gRNA对应的DNA序列SEQIDNo.2或者SEQIDNo.20-36中的 任一个序列；

第二、根据第一步设计的gRNA，将对应的DNA插入到CRISPR-Cas9载体质粒中，构建功能 质粒,该质粒具有以下特点：

①该质粒带有核酸酶Cas9表达读码框、CRISPR其他相关基因序列和慢病毒包装信号；

②针对CCR5Δ32位点两侧的gRNA，如第一步所述；

第三、包裹CRISPR-Cas9质粒的慢病毒颗粒的制备：

将第二步构建的CRISPR-Cas9质粒和包装质粒PMD2.G、psPAX2共同转染到HEK293T细胞 中，一段时间后收取细胞上清液，该上清中含有我们所需要的慢病毒颗粒；

第四、将第三步获得的慢病毒颗粒感染目的细胞，就能够获得CCR5Δ32/Δ32纯合子细 胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的目标序列还可以是SEQIDNo1.和 SEQIDNo.20-36的任意组合；SEQIDNo2.和SEQIDNo.20-36的任意组合；……SEQID No19.和SEQIDNo.20-36的任意组合；由于CRISPR-Cas9的容错性,个别碱基发生改变,也 可以被识别，因此只要带有种子DNA序列“5’taatgtc3’”和“5’gactgta3’”的gRNA针对于 CCR5Δ32缺失就在本发明保护范围内。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述切割使用的核酸酶还可以是Cas9的突 变体——Cas9切口酶，或者其他的Cas9突变体，或者核酸酶FokI。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的质粒载体可以不是慢病毒载体，而是 腺病毒载体；或者其他的带有CRISPR-Cas9的任意质粒载体。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法可以不是慢病毒感染，可以是质 粒直接转染。