[发明专利]用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌试剂盒与检测方法

说明书

技术领域

本发明属于耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)检测技术领域，具体涉及碳青 酶烯酶基因KPC、NDM、IMP、VIM和OXA-48的检测试剂盒及其检测 方法。

背景技术

碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广，抗菌活性最强的非典型β-内酰胺抗 生素，因其具有对β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点，已经成为治疗严重 细菌感染最主要的抗菌药物之一。随着其在临床中的广泛应用，碳青霉烯类 抗生素出现严重的耐药现象，耐药细菌表现为广泛耐药。2000年以前，未 见碳青霉烯酶广泛流行的报道，更多的是AmpC酶或者ESBL合并膜孔蛋白 丢失造成碳青霉烯耐药的报道；2001年，美国北卡罗来纳州首次报道KPC (该菌是1996年在ICU分离出的一株细菌)；2004年，美国纽约布鲁克林 地区报道了KPC的暴发流行；从1996年到2006年间，KPC风行美国全国； 过去的十年，CRE逐渐成为威胁人类健康的一个重要问题。碳青霉烯耐药的 肠杆菌(Carbapenem-ResistantEnterobacteriaceae)或耐碳青霉烯肠杆 菌，包括肠杆菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌、肺炎克雷伯菌等，具有特点包 括(1)所致感染病死率高；(2)意味着泛耐药，治疗方案有限(3)位于质 粒上的耐药基因在不同种的细菌间传递；(4)耐药转移速度快：从院内到社 区；因此对于耐药菌株的快速检测对于患者抗生素精准治疗，减少抗生素滥 用具有极为重要的临床意义。

越来越多研究表明，细CRE耐药机理主要包括：碳青霉烯酶与头孢菌 素酶合并膜孔蛋白丢失。产碳青霉烯酶基因存在多重，包括KPC、NDM-1、 IMP、VIM与OXA-48等这5种最流行的碳青霉烯类抗菌药物耐药机制。 KPC是引起肠杆菌科细菌碳青酶烯主要原因，KPC的基因型已达约20种， 目前流行的主要是KPC-2和KPC-3；NDM基因大约有12种NDM基因型， 是引起全球关注的新发水解活性极强的碳青霉烯酶；IMP和VIM是临床中 最为常见的金属β-内酰胺酶。OXA-48高度水解青霉素，轻度水解碳青霉 烯类药物(活性中心无疏水桥)，对IPM的活性大于MEM。

目前用于CRE基因型检测的方法有多种类型，包括PCR法、环介导等 温扩增方法、基因芯片等，这些方法存在检测通量低、集成程度差、检测费 用相对较高等问题。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明针对爆发流行最常见、最关键的基 因，采用多重扩增技术，结合CFX96Touch^TM荧光定量PCR、biometra Toptical型荧光定量PCR等6通道检测系统，单次反应检测以上五种基因 的多种亚型，为临床工作者鉴定CRE基因型，缩短时间、降低成本具有极 大的临床意义。

本发明目的之一提供一种用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)的试剂 盒，试剂盒中包括下述组合物：检测引物对和检测探针。本发明的目的之二 还在于提供基于该检测引物对和检测探针的根进一步的试剂盒及检测方法。 本发明的组合物、试剂盒及检测方法能够多重扩增分别检测KPC、NDM与 IMP、VIM、OXA-48等耐药基因，并且实现耐药基因定量测定。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌的试剂盒，包括下述检测引物 对中的至少一对：

检测引物对1：

KPC上游引物为：5′-ATCGCCGTCTAGTTCTGCTG-3′，如SEQID NO.1所示，

KPC下游引物为：5′-TATCCATCGCGTACACACCG-3′，如SEQID NO.2所示；

检测引物对2：

NDM上游引物为：5′-GCAAATGGAAACTGGCGACC-3′，如SEQ IDNO.4所示，

NDM下游引物为：5′-TCAAACCGTTGGAAGCGACT-3′，如SEQID NO.5所示；

检测引物对3：

IMP上游引物为：5′-TTCAGTTGGTTCAGTTGTTGGTG-3′，如SEQ IDNO.7所示，

IMP下游引物为：5′-TGGATTAAATAGCCAAACTGACGC-3′，如 SEQIDNO.8所示；

检测引物对4：