[发明专利]过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及构建

说明书

过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及构建，属于基因工程及微生物发酵技术领域。克隆了多糖絮凝剂合成途径的关键酶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，利用大肠杆菌－芽孢杆菌穿梭质粒构建重组表达载体。通过电转化的方法将重组质粒导入到地衣芽孢杆菌，构建了重组地衣芽孢杆菌HN301‑2，构建的重组地衣芽孢杆菌比出发菌株的多糖絮凝剂产量提高了15.6％，发酵液絮凝活性提高了70％。可望用于多糖絮凝剂的工业化生产，提高产量，降低成本。

技术领域

本发明属于基因工程及微生物发酵技术领域，具体是涉及一株过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法。

背景技术

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase)在植物、动物和细菌中广泛分布，是一种与糖代谢密切相关的酶。它催化生成的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是葡萄糖的主要活化形式，可作为葡萄糖基的供体，在细胞内作为蔗糖、淀粉、纤维素、半纤维素、果胶质以及糖脂、糖蛋白、糖原、β-葡聚糖等多种碳水化合物的前体。已有研究表明尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(gtaB)是多糖生物合成的关键酶基因(Journal of Bacteriology,176(9):2611-2618；Biochemical Journal,370(1):995-1001)。

微生物絮凝剂(Microbial flocculant,MBF)是微生物分泌的能够使悬浮液中的固体颗粒、菌体、细胞和胶状物絮凝沉淀的大分子化合物，主要成分有多糖、糖蛋白、蛋白质、纤维素和DNA等。微生物絮凝剂具有安全、高效、可生物降解和对环境无污染等优势，且能产生絮凝剂的微生物种类多、生长快、易于采用工程手段而实现产业化。因此微生物絮凝剂的开发前景十分看好。目前，多糖生物絮凝剂已经应用于去除纺织印染废水中的色素(Colloids and Surfaces B-Biointerfaces,2005,44(4):179-186.)，还可以去除工业废水中的重金属离子和其它悬浮污染物(Bioresource Technology,2007,98(2):361-367.)。然而多糖絮凝剂产量低、成本较高，制约着它的大规模工业化应用。目前，对于培养基、培养条件、生长因子等外部因素影响多糖絮凝剂合成的报道已经很多(Process Biochemistry,2014,49(4:576-582；Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2014,116:257-264)。而从地衣芽孢杆菌的遗传及生理学角度对其多糖絮凝剂合成量影响的报道甚是少见。由于多糖絮凝剂结构复杂，且大多数针对多糖的研究并不关注絮凝活性，所以有关多糖絮凝剂代谢途径的研究还较少，而通过分子生物学技术改造菌株提高多糖絮凝剂产量的报道几乎没有。因此通过基因工程技术构建高产优良菌株，进一步提高多糖絮凝剂活性及产量，具有重要的经济价值及社会意义。

本申请人在中国专利CN101503709中公开利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，其中，微生物地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2876。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中多糖絮凝剂絮凝活性不高、调控机理不明等问题，提供一株过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(gtaB)的地衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法。

所述过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(gtaB)是编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化生成的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是葡萄糖的主要活化形式，也是合成多糖絮凝剂的必需前体，基于以上理论分析，过表达gtaB基因，能够增大多糖絮凝剂合成途径的代谢流量，有利于提高多糖絮凝剂的产量，降低成本。

利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径的关键酶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB。