[发明专利]过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及构建

权利要求书

1.尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，其特征在于是地衣芽孢杆菌中编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因，命名为gtaB，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

2.过表达权利要求1所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢杆菌基因工程菌的制备方法，其特征在于其具体步骤如下：

将权利要求1所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因插入到表达载体上，然后利用电转化的方法导入到地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中，通过抗性筛选获得目的基因的工程菌，即过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢杆菌基因工程菌；所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2876。

3.如权利要求2所述方法，其特征在于所述表达载体为pHY300PLK-PamyL-TTamyL，所述表达载体的启动子为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因的启动子PamyL。

4.如权利要求2所述方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)设计PCR引物扩增所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB；

(2)将扩增得到的目的基因插入到pHY300PLK-PamyL-TTamyL组成型启动子PamyL下游多克隆位点，得到pHY300-gtaB过表达质粒；

(3)然后将pHY300-gtaB过表达质粒导入到E.coli DH5α中，以备扩增后电转化；

(4)将经提取、浓缩后的pHY300-gtaB过表达质粒电转化所述地衣芽孢杆菌CGMCCNo.2876，37℃复苏5h后，涂布四环素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子；

(5)转化子经质粒提取后，利用PCR和双酶切进行验证，从而获得过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢杆菌基因工程菌。

5.如权利要求2所述方法制备的过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢杆菌基因工程菌在制备多糖絮凝剂中应用。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于所述多糖絮凝剂的制备方法包括以下步骤：

(1)刮一环地衣芽孢杆菌基因工程菌接种于液体种子培养基中培养，得种子培养液；所述培养的条件为：35～37℃，200r/min培养12～16h；

(2)按体积百分比以4％的接种量接种于多糖絮凝剂发酵培养基中培养，得发酵液；所述培养的条件为：在30～40℃，150～300r/min条件下培养50～60h；

(3)将发酵液离心收集上清液，再用乙醇提取，所得提取液冷冻真空干燥后即得多糖絮凝剂。

7.如权利要求6所述应用，其特征在于在步骤(2)中，所述培养的条件为：在37℃，200r/min的条件下培养48～56h。

8.如权利要求6所述应用，其特征在于在步骤(3)中，所述乙醇与上清液的体积比为3∶1；所述提取的条件为：离心的速度为6000～8000rpm，离心的时间为10～15min，离心的温度为4℃。