[发明专利]一种鉴别空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌双重PCR引物及其鉴别方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种双重PCR引物及其鉴别方法。

背景技术

空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)和结肠弯曲杆菌(Campylobactercoli)属于弯曲杆菌属，是人畜共同感染的细菌性肠道病原菌，可以引起人和动物发生多种疾病。弯曲杆菌对动物和人类表现出不同程度的危害，禽类感染该菌一般会导致下痢、肝脏变性出血及产蛋下降为等症状，火鸡则会引发肝炎和蓝冠病；空肠弯曲杆菌还可引起羊流产，对养殖业造成极大的经济损失。对人类致病主要表现为急性肠炎，免疫力低下者还会继发格林-巴利综合征(Guillain-Barrisyndrome，GBS)。弯曲杆菌主要通过饮水，食物等方式传染给动物和人类，其感染的病例数已经超过李斯特菌病，沙门菌病和志贺菌病，在引起的感染中超过80％是由空肠弯曲杆菌引起，约10％是由结肠弯曲杆菌引起，其他弯曲杆菌也偶尔致病。

近年来，我国鸡群大规模爆发弯曲杆菌病的报道也越来越多，虽然发病率高、死亡率低、多呈慢性经过，但其对鸡群潜在的影响却不容忽视，空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌感染的临床症状不明显且不易区分，因此很难通过临床症状判断感染情况。建立快速而特异的检测方法是有效诊断空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌感染的关键所在。目前对弯曲杆菌的常规检测鉴定主要是增菌培养生化鉴定，但是由于空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌在食品样品中的含量很低，生长条件比较苛刻，常规检测及鉴定方法繁琐耗时，伴随着假阳性和假阴性菌株的不断发现，一些初步的生化试验项目已经不能有效鉴别出空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌，传统的鉴别方法面临着巨大的挑战,因此有必要寻找更加有效地鉴别空肠弯曲菌的检测方法。近年来随着分子生物学，特别是PCR方法快速发展，已成为快速，可靠和灵敏检测病原体感染的工具。PCR检测方法目前已经广泛运用到细菌的分离鉴定之中，它具有快速简单、特异性强和敏感性高等特点。已报道的PCR方法常用的靶基因有16SrRNA、23SrRNA、flaA或flaB、ceuE、cadF、hipO、cdtABC、glyA等，其中hipO是空肠弯曲杆菌所特有的，它可以有效鉴别空肠弯曲杆菌。细胞致死性膨胀毒素cdtC，是结肠弯曲杆菌重要的毒力因子之一。

发明内容

本发明提供了一种鉴别空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌双重PCR引物及其鉴别方法。

本发明选择hipO，cdtC为靶序列，设计特异性引物，建立双重PCR方法用于空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的鉴别。

本发明的一种鉴别空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌双重PCR引物，是根据GenBank中发表的空肠弯曲杆菌hipO基因序列和结肠弯曲杆菌cdtC基因序列，设计2对特异性引物，具体如下：

hipOFATCAACATTGCGAGATAC；

hipORTAGACTTACAAGGCGAAT；

cdtCFGGATATGCACTCTCAAGATTTG；

cdtCRCTTGCTTAGTTCGGTTACAATAG。

本发明的一种鉴别空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的双重PCR方法，它是按照以下步骤进行的：

一、提取待检测样本的基因组DNA；

二、以步骤一的基因组DNA为模板，将上述的引物对放入同一PCR反应体系中，进行PCR扩增；

三、PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测；

四、对扩增片段进行分析：在653bp和313bp位置有两条扩增条带，表示样品为阳性，待检测样品中同时含有空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌。

本发明包含以下有益效果：