[发明专利]GII型诺如病毒病毒样颗粒的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有诺如病毒GII型基因的病毒样颗粒的制备方法及应用。

背景技术

诺如病毒，又称诺瓦克病毒（NorwalkViruses，NV）是人类杯状病毒科(HumanCalicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）属的原型代表株。它是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻患者粪便中分离的病原。2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒，它与在日本发现的札幌样病毒，合称为人类杯状病毒。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻暴发中，60-90%是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15%左右，血清抗体水平调查表明中国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。

目前，食品中诺如病毒GII型检测的常用方法有RT-PCR技术和荧光定量RT-PCR技术，为了保证检测的准确性，实验中必须设立阳性对照或质控品。通常使用病毒培养物或是由RNA逆转录得到的cDNA做标准品，但是前者存在生物安全的隐患且易被核糖核酸酶降解，后者不能体现核酸提取过程和反转录对试验的影响。本发明采用ArmoredRNA技术，构建包裹甲肝病毒基因的假病毒标准样品，此假病毒标准样品能够避免核糖核酸酶对RNA的降解，作为质控品可以对从核酸提取至RT-PCR检测的全过程进行有效的监控。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：构建包裹NV-GII基因的病毒样颗粒假病毒和标准样品，此假病毒标准样品能够避免核糖核酸酶对RNA的降解，作为质控品可以对从核酸提取至RT-PCR检测的全过程进行有效的监控。

本发明为解决上述技术问题，将编码组氨酸标签序列插入MS2噬菌体编码外壳蛋白的β发夹环结构序列中，构建含有重组组氨酸标签的MS2噬菌体外壳蛋白和表达成熟酶蛋白基因的pNH-MS2his重组质粒。并通过RT-RCR技术扩增NV-GII基因，将其克隆于pNH-MS2his中，构建原核重组表达质粒pNH-MS2his-NV-GII。并将其转化于表达大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。结果表明，表达的重组蛋白能够自主装配形成VLPs，而且其中含有NV-GII的基因RNA序列，并且该RNA序列具有良好的稳定性，可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品用于临床及海关样品检测。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

首先，本发明设计了一组扩增NV-GII基因引物，序列如下：

NV-GIIf1：ATACCACAATGATACCACACTCCCA

NV-GIIr1：AAGAGGACACTGTGAACTCTCCAC

引物5‘端分别加上HindII和NotI酶切位点。

5‘端和3’端分别加上HindIII和NotI酶切位点。

本发明提供一种pNH-MS2his重组质粒，pNH-MS2his重组质粒中插入的NV-GII基因片段序列如下：

ACAATGATACCACACTCCCAAAGACCCATACAACTAATGTCTTTGCTGGGCGAGGCCGCACTCCACGGCCCAGCATTCTACAGCAAAATTAGCAAGCTAGTCATTGCAGAACTGAAGGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCC。

本发明还提供一种制备含有NV-GII基因的病毒样颗粒标准物质的方法

包括以下步骤:

（1）含有组氨酸标签的VLPs重组质粒pET-NH-MS2his的构建