[发明专利]GII型诺如病毒病毒样颗粒的制备方法及其应用

权利要求书

1.一组扩增NV-GII基因的引物，其特征在于，序列如下：

NV-GIIf1：ATACCACAATGATACCACACTCCCA；

NV-GIIr1：AAGAGGACACTGTGAACTCTCCAC；

引物5‘端分别加上HindII和NotI酶切位点。

2.一种pNH-MS2his重组质粒，其特征在于，pNH-MS2his重组质粒中插入的的NV-GII基因片段序列如下：

ACAATGATACCACACTCCCAAAGACCCATACAACTAATGTCTTTGCTGGGCGAGGCCGCACTCCACGGCCCAGCATTCTACAGCAAAATTAGCAAGCTAGTCATTGCAGAACTGAAGGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCC。

3.制备含有NV-GII基因的病毒样颗粒标准物质的方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）含有组氨酸标签的VLPs重组质粒pET-NH-MS2his的构建

将pET32a质粒使用XbaI和NcoI消化，去除其中的XbaI和NcoI两个酶切位点间的序列，将人工合成的5’-PO4-CTAGATTACAAGGC-3’和5’-PO4-CATGGCCTTGTAAT-3’两条互补的寡核苷酸复性后插入其中，构建重组质粒pET-NH，测序鉴定；

采用一步法扩增试剂盒以MS2Pf1和MS2Pr1为引物,以MS2RNA为模板扩增MS2目的片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收目的片段，用50μLddH2O洗脱，标记为MS2DNA；

采用OneStepRT-PCR，以得到的MS2DNA为模板，分别用引物MS2Pf1和ms2hispr以及ms2hispf和MS2Pr1扩增MS2上和MS2下2个DNA片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用胶回收试剂盒回收后，存于4℃备用；再以2个片段的混合物为模板，以MS2Pf1和MS2Pr1为引物做PCR，得到引入了编码组氨酸标签序列的MS2DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收后的PCR产物命名为MS2his；

分别将制备的pET-NH载体和回收的MS2his片段用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ进行酶切消化；将双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用胶回收试剂盒回收后与pET-NH载体用SolutionⅠ连接酶进行连接；连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落作进行酶切鉴定；从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有Amp抗生素的液体培养基中，37℃振荡培养12-16小时，参照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取；以提取的质粒为模板，以MS2Pf和MS2Pr为引物进行PCR扩增；将PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测；若可见载体与1700bp的MS2目的片段即为阳性；

（2）构建原核表达载体pNH-MS2his-NV-GII

按RNA提取试剂盒说明书的方法提取NV总RNA作为模板，以NV-GIIf1和NV-GIIr1，为引物，扩增NV-GII蛋白基因，RT-PCR体系为：5×RT-PCRbuffer5μL，dNTPmix1μL，EnzymeMix1μL，引物NF和NR各1μL，RNA模板5μL，ddH2O补足25μL，反应条件为,50℃反转录30min，95℃灭火变性10min，然后95℃1min，55℃1min，72℃1min，40个循环，最后72℃延伸10min；扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见430bp的条带，宝生物凝胶回收试剂盒回收NV-GII蛋白片段；

HindⅢ和NotⅠ双酶切pNH-MS2his和NV-GII蛋白片段，胶回收试剂盒回收酶切的pNH-MS2his和NV-GII蛋白片段，回收产物16℃连接过夜；连接体系为载体pNH-MS2his和NV-GII蛋白片段分别为2μL和6μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4连接酶buffer1μL；连接产物转化DH5α感受态细胞，将涂板后获得的重组克隆进行PCR鉴定；将阳性克隆菌种送测序，鉴定为阳性的重组载体命名为pNH-MS2his-NV-GII；

（3）诱导及纯化重组pNH-MS2his-NV-GII质粒

将测序正确的pNH-MS2his-NV-GII质粒转化表达菌株BL21（DE3），将阳性克隆菌株接种于氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L,诱导表达6h；离心收集菌体；菌体中加入裂解缓冲液重悬，于冰上放置30min，离心去除菌体碎片，将上清加入预装有Ni-NTA的纯化柱中，使液体自然流出，加入3倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤2次，然后加入洗脱缓冲液将病毒样颗粒洗脱，命名为NV-GII-VLPs。