[发明专利]启动子NtR12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白藜芦醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及启动子NtR12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白藜芦醇的方法， 属于植物基因工程领域。

技术背景

白藜芦醇（Resveratrol，简称Res），是一种重要的植物抗毒素，存在于虎杖、葡萄、 花生等植物中，在葡萄果皮和花生根中含量尤为丰富。它具有多种生物活性，是一种天然的 抗氧化剂，可以降低血脂，抑制血小板凝结，抗癌，抗炎，抗辐射，抗衰老，防治心血管疾病 等。它与紫杉醇都被誉为绿色抗癌药物。但自然界中存在的白藜芦醇的含量较少，利用植物 基因工程技术高效生产白藜芦醇是大量获得白藜芦醇的重要途径。

白藜芦醇广泛存在于种子植物中，作为芪类次生代谢物，主要通过苯丙氨酸代谢 途径合成的。刘蕾等克隆了白藜芦醇合酶cDNA，并将其转化花生的下胚轴、胡萝卜的下胚轴； 同时，也把花生RESS转化酵母。许玉芬等成功构建了花生白藜芦醇合酶基因的酵母表达载 体，并通过电穿孔法将其整合到毕赤酵母的染色体上；成功构建了由Ubi启动子驱动的花生 白藜芦醇合酶基因单子叶植物表达载体，分别利用农杆菌介导和基因枪转化法转导甘蔗。 黄国强等研究了白藜芦醇合酶基因在花生根中的特异表达，研究结果表明：该基因的转录 表达在根的韧皮部，其他组织中未见表达；酵母浸提液处理可使该基因的转录表达明显增 强。林荣华等以花生中的白藜芦醇合酶基因为目的基因，构建了含目的基因的植物重组表 达载体pB6RS，利用电穿孔法将pB6RS质粒直接导入根癌农杆菌LBA4404中，通过农杆菌介导 将pB6RS转化烟草（云烟85），得到了阳性植株。

由于白藜芦醇的重要生理功能，近几年，人们开始研究利用生物技术提高植物材 料中白藜芦醇的含量。Giovinazzo等研究者以35S启动子调控白藜芦醇合酶基因进行番茄 遗传转化，测定转基因番茄中的抗坏血酸盐与谷胱甘肽还原酶的总体水平，结果表明：转基 因植物的抗氧化性较之野生型植物的抗氧化性有了显著的提高。Hüsken等利用油菜种子特 异表达启动子驱动白藜芦醇合酶基因表达，转化油菜，同时，阻断消耗白藜芦醇合酶底物的 另一条支路，检测T₀代油菜种籽中的Res含量，发现以鲜重计其最高含量为361μg/g，同时 还获得了品质改善且保健性提高的油菜种籽。但目前，通过根特异启动子驱动白藜芦醇合 酶基因表达生产白藜芦醇的研究未见报道。

发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）是一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够侵 染大多数双子叶植物和少数单子叶植物及裸子植物，诱导植物产生发状根(毛状根)。发状 根相对于正常的根，有很多优点。理论上，发状根来源于一个植物细胞，不是嵌合体，所以其 遗传性状稳定，继代多次仍然具有原始发状根的遗传特性；发状根能够在无外源激素的培 养基中自主生长，且生长速度快，易操作和调控，不受季节和地域限制；某些次生代谢产物 在发状根中含量比正常根高。因此，利用发状根生产次生代谢产物是一条可靠和有效的途 径。

本发明针对以上研究背景，利用发根农杆菌介导pBI121-NtR12-AhRESS遗传转化 本生烟草，获得根特异启动子NtR12驱动AhRESS表达的转基因本生烟草发状根，通过发状根 液体悬浮培养技术，快速获得大量发状根，进而用于白藜芦醇的生产。该发明为利用烟草根 特异启动子NtR12驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS在本生烟草发状根中特异表达，进而 生产白藜芦醇提供了良好的基础。

发明内容

本发明利用烟草根特异表达启动子，驱动花生白藜芦醇基因，构建了pBI121- NtR12-AhRESS根特异表达载体，通过冻融法把pBI121-NtR12-AhRESS导入发根农杆菌；通过 发根农杆菌介导把NtR12:AhRESS融合基因整合到本生烟草基因组，获得根特异启动子 NtR12驱动AhRESS表达的转基因本生烟草发状根，建立了发状根液体悬浮培养技术，快速获 得大量发状根，进而用于白藜芦醇的生产。实现了本生烟草发状根生产白藜芦醇。

本发明提供了启动子NtR12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白藜芦醇的方 法。目的在于提供烟草根特异启动子NtR12驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS在本生烟草 发状根中特异表达，进而生产白藜芦醇的技术，以便利用植物基因工程手段高效生产白藜 芦醇。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

启动子NtR12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白藜芦醇的方法，包括以下步骤：