[发明专利]启动子NtR12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白藜芦醇的方法在审
| 申请号： | 201610025955.1 | 申请日： | 2016-01-15 |
| 公开（公告）号： | CN105505989A | 公开（公告）日： | 2016-04-20 |
| 发明（设计）人： | 陈华;庄伟建;马世伟;张冲;蔡铁城;邓烨 | 申请（专利权）人： | 福建农林大学 |
| 主分类号： | C12N15/84 | 分类号： | C12N15/84;A01H5/06 |
| 代理公司： | 福州元创专利商标代理有限公司 35100 | 代理人： | 蔡学俊 |
| 地址： | 350002 福*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 启动子 ntr12 驱动 ahress 基因 本生 烟草 发状根产白 藜芦 方法 | ||
1.启动子NtR12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白藜芦醇的方法，其特征在于：包 括以下步骤：
（1）克隆烟草根特异启动子NtR12和花生AhRESS基因；
（2）烟草根特异启动子NtR12驱动花生AhRESS基因表达载体pBI121-NtR12-AhRESS的构 建；
（3）pBI121-NtR12-AhRESS经发根农杆菌介导转化本生烟草；
（4）转pBI121-NtR12-AhRESS本生烟草发状根液体悬浮培养；
（5）转pBI121-NtR12-AhRESS本生烟草发状根白藜芦醇含量的检测。
2.根据权利要求1所述的启动子NtR12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白藜芦醇 的方法，其特征在于：所述步骤（1）中所述烟草根特异启动子NtR12的序列为SEQIDNo：1， 花生AhRESS基因的序列为SEQIDNo：2。
3.根据权利要求1所述的启动子NtR12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白藜芦醇 的方法，其特征在于：步骤（2）具体方法为：
1）将烟草根特异启动子NtR12连接至pMD18-T载体中，得到pMD18-NtR12载体；
2）pBI121-NtR12-GUSA载体构建：将pBI121载体进行酶切，切除该载体上的GUSA基因， 从pCAMBIA-1301载体中克隆GUSA基因连接至pBI121载体上，构建pBI121-GUSA；将pBI121- GUSA载体进行酶切反应，切除35S启动子，将pMD18-NtR12载体进行酶切反应，将NtR12启动 子连接至pBI121-GUSA载体中，得到pBI121-NtR12-GUSA载体；
3）pBI121-NtR12-AhRESS载体的构建：将花生AhRESS基因连接到pBI121-NtR12-GUSA载 体中，得到pBI121-NtR12-AhRESS载体。
4.根据权利要求1所述的启动子NtR12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白藜芦醇 的方法，其特征在于：所述步骤（3）中发根农杆菌其介导的本生烟草遗传转化采用叶盘法。
5.根据权利要求1所述的启动子NtR12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白藜芦醇 的方法，其特征在于：所述步骤（4）中转pBI121-NtR12-AhRESS本生烟草发状根液体悬浮培 养所用培养基为MS培养基+500mg/LCef，第一次继代培养基为MS培养基+300mg/LCef， 第二次继代培养基为MS培养基+100mg/LCef，第三次继代培养基为MS培养基，三次继代后 头孢霉素浓度降至0。
6.根据权利要求1所述的启动子NtR12驱动AhRESS基因在本生烟草发状根产白藜芦醇 的方法，其特征在于：所述步骤（5）中转pBI121-NtR12-AhRESS本生烟草发状根白藜芦醇含 量的检测方法为HPLC，色谱条件为：色谱柱ODS(250mm×4.6mm×5μm)，流动相乙腈：水 =25:75，流速1.0mL/min，检测波长306nm，柱温25℃，进样量10μL。
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