[发明专利]一种快速检测水体中小瓜虫的方法

说明书

本发明涉及一种快速检测水体中小瓜虫的方法，根据养殖水域大小，采集水样；水样进行处理后，提取水体中的总DNA；利用已知核苷酸序列IC‑ITS‑F 5'‑GTTCCCCTTGAACGAGGAATTC‑3'和IC‑ITS‑R 5'‑TTAGTTTCTTTTCCTCCGC‑3’作为引物进行PCR扩增，得到PCR产物，将上述PCR产物连接载体后转入大肠杆菌DH5α中进行克隆，利用DNAMAN6.0软件对测序结果进行比对后，查找小瓜虫与其它可测得的相似种之间的差异位点并设计出针对小瓜虫的巢氏PCR引物，利用引物对第一次PCR产物进行巢氏PCR，电泳检测结果显示，有小瓜虫可扩增出条带，即可完成检测。采用该方法十分简便高效的检测了水体中小瓜虫的存在情况，为及时进行水体处理，防止小瓜虫的爆发提供了有效途径，极具实用价值，值得推广。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及水体中小瓜虫DNA样本的采集、提取、扩增及鉴定方面，具体是指一种水体小瓜虫快速检测方法。

背景技术

小瓜虫属于原生动物门、纤毛虫纲、膜口目、凹口科、小瓜虫属，是一种世界性分布的淡水鱼类寄生虫，在高密度水产养殖中引起鱼类暴发性感染，导致大批鱼死亡，造成巨大经济损失。

为了有效控制该病的发生，国内外研究学者探讨了该病病原的部分生物学特性、病理特点、物理化学及中草药对离体小瓜虫的杀灭效果、小瓜虫不同免疫疫苗的制造。除基础研究外治疗性实验的结果不是效果不理想就是应用性较差。综合养殖经验和实验结果来看，目前对于小瓜虫病的防治策略应以防为主，治为辅。所以，及时了解水体中小瓜虫的存在状态，提前做好水体处理或及时转走养殖鱼体，是防止小瓜虫病爆发的最佳途径。

发明内容

本发明的内容是为了及时发现水体中小瓜虫的存在情况，提供一种高效、快捷、准确的水体小瓜虫检测方法，为最终通过小瓜虫DNA浓度来判断爆发小瓜虫病的可能性奠定基础，用以指导实际的养殖操作。

为实现上述目的，本发明提供了一种快速检测水体中小瓜虫方法，包括以下步骤：

步骤1：根据养殖水域大小，采集水样；

步骤2：将水样进行处理后，提取水体中的总DNA；

步骤3：利用核苷酸序列IC-ITS-F和IC-ITS-R作为引物进行PCR扩增，得到PCR产物750bp，电泳检测；

步骤4：将上述PCR产物切胶回收，连接载体后转入大肠杆菌DH5α中进行克隆，并尽可能多的挑取单克隆个体进行测序；

步骤5：利用DNAMAN6.0软件对测序结果进行比对，找出小瓜虫与测得的相似种之间的差异位点并设计出至少2对针对小瓜虫的巢氏PCR引物；

步骤6：利用上述引物对步骤3得到的PCR产物进行巢氏PCR，知道电泳检测结果显示，有小瓜虫可扩增出条带，即可完成对水体中小瓜虫的检测。

所述步骤1的采集水样为所需检测的养殖池池底、池壁不同范围内水样或水塘排水口不同 时间段的水样等体积混合物。

所述步骤2中的水样处理为对所述水样采用25μm滤膜进行真空抽滤，抽滤后将所述的滤膜放入装有35ml无菌水的50ml离心管中，于涡旋振荡器上震荡混匀，8000rpm离心5min，收集沉淀于-20℃保存；对沉淀物加入新的无菌水，反复吹洗后，装于1.5ml的离心管中，10000rpm离心5min，弃上清备用。

所述步骤2中总DNA的提取采用试剂盒方法，凝胶电泳检测DNA提取情况后于-20℃保存备用。