[发明专利]一种快速检测水体中小瓜虫的方法

权利要求书

1.一种快速检测水体中小瓜虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：根据养殖水域大小，采集水样；

步骤2：将水样进行处理后，提取水体中的总DNA；

步骤3：利用核苷酸序列IC-ITS-F 和IC-ITS-R 作为引物进行PCR扩增，得到PCR产物750bp，电泳检测；所述的引物核苷酸序列IC-ITS-F 和IC-ITS-R 分别为IC-ITS-F 5'-GTTCCCCTTGAACGAGGAATTC-3'和IC-ITS-R 5'-TTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3’；

步骤4：将上述PCR产物切胶回收，连接载体后转入大肠杆菌DH5α中进行克隆，并尽可能多的挑取单克隆个体进行测序；

步骤5：利用DNAMAN6.0软件对测序结果进行比对，找出小瓜虫与测得的相似种之间的差异位点并设计出2对针对小瓜虫的巢氏PCR引物，具体如下：

n-IC1-F：5’-GGTGAACCTTCTGGACCGAGGT-3’ ，

n-IC1-R：5’-ATTAAGATACATGATTCCTTTC-3’ ，

n-IC2-F：5’-AATAAAATACCTTCATATGTCT-3’ ，

n-IC1-R：5’-ATTAAGATACATGATTCCTTTC-3’ ；

步骤6：利用上述引物对步骤3得到的PCR产物进行巢氏PCR，直到电泳检测结果显示，有小瓜虫可扩增出条带，即可完成对水体中小瓜虫的检测。

2.根据权利要求1所述的快速检测水体中小瓜虫的方法，其特征在于，所述步骤1的采集水样为所需检测的养殖池池底、池壁不同范围内水样或水塘排水口不同时间段的水样等体积混合物。

3.根据权利要求1所述的快速检测水体中小瓜虫的方法，其特征在于，所述步骤2中的水样处理为对所述水样采用25μm滤膜进行真空抽滤，抽滤后将所述的滤膜放入装有35ml无菌水的50ml离心管中，于涡旋振荡器上震荡混匀，8000rpm离心5min，收集沉淀于-20℃保存；对沉淀物加入新的无菌水，反复吹洗后，装于1.5ml的离心管中，10000rpm离心5min，弃上清备用。

4.根据权利要求1所述的快速检测水体中小瓜虫的方法，其特征在于，所述步骤2中总DNA的提取采用试剂盒方法，凝胶电泳检测DNA提取情况后于-20℃保存备用。

5.根据权利要求1所述的快速检测水体中小瓜虫的方法，其特征在于，所述步骤3中PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min；

PCR扩增反应体系为每25μl体系中：10×buffer 2.5 μl，MgCl₂ 25mM 3μl，dNTPs 2.5mM2μl，浓度为100pmol/μl的正反引物各0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶 5U/μl 0.25μl，ddH₂O15.25μl；

电泳检测上述PCR产物于1%的琼脂糖凝胶中，电压120V电泳15min，最后在凝胶成像系统上拍照即可完成电泳检测。

6.根据权利要求1所述的快速检测水体中小瓜虫的方法，其特征在于，所述步骤4中挑取的单克隆个体为20-40个。

7.根据权利要求1所述的快速检测水体中小瓜虫的方法，其特征在于，所述步骤6中，巢氏PCR的扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min；

PCR扩增反应体系为每25μl体系中：10×buffer 2.5 μl，MgCl₂ 25mM 3μl，dNTPs 2.5mM2μl，浓度为100pmol/μl的正反引物各0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶 5U/μl 0.25μl，ddH₂O15.25μl。