[发明专利]基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质纯化技术领域，具体涉及一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法及其应用。

背景技术

现代生物医药产业的高速发展，要求生物材料的性能逐步提高。以琼脂糖制备的亲和层析介质广泛运用于蛋白质的分离工程中，介质性能直接决定了分离纯化的效率。

琼脂糖作为一种富含有羟基，具有良好的生物可溶性，是分离纯化过程中，运用最广泛的基质合成材料。但是，由于普通的琼脂糖微球硬度较低，在高压的条件下容易产生形变，减低微球间空隙的大小，直接导致纯化介质的流速降低；而一味的提高流速会直接导致琼脂糖微球的破裂，影响纯化效果。基于此种局限性，通常会对琼脂糖微球进行交联和改性。现有报道中，常见的交联剂为含有环氧、Cl和Br等活性较高官能团的有机物。较早的报道如PorathJC(1975,journalofchromatography10349-62)等利用碱性条件下，环氧氯丙烷与琼脂糖微球进行反应，制备拥有一定机械强度的微球。PernemalmP等在专利EP0203049A1中报道，通过一种分步交联的方法，实现琼脂糖微球的高度交联，即利用含有多个环氧官能团的有机物如1,4-丁二醇缩水甘油醚、三环氧丙基异氰尿酸酯等，利用这些有机物较长的分子链，先对琼脂糖的空间结构进行稳定，而后利用环氧氯丙烷对琼脂糖微球的结构进行加强，获得拥有较高强度的微球。

与此同时，为了获得较高纯度的目标蛋白，减少分离步骤、降低生产成本，需要利用特殊手段对琼脂糖进行改性。镍金属亲和层析就是利用含有六个组氨酸标签的重组蛋白，能够特异性结合于金属镍上。正是利用这一特性，我们能够制备出含有镍的亲和纯化介质。PorathJ等在1975年首次报道了利用金属离子能够与蛋白之间发生亲和作用，并成功的利用这一特性实现了对目标蛋白的分离和纯化。

然而，由于天然琼脂糖中含有大量的含硫的物质，且难以处理干净。使得纯化过程中纯化介质带有电荷效应，对样品中的杂蛋白产生吸附作用，影响洗脱效果。因此，需要克服琼脂糖微球的电荷效应这种理化性质，提高蛋白质纯化效果。

发明内容

本发明的目的是克服现有琼脂糖微球中交联步骤繁琐，交联后介质偶联配基密度较低以及琼脂糖理化性质影响纯化效果的问题。

为此，本发明提供了一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.1～0.5:0.5～0.9:1进行混合，在反应温度为25～70℃的条件下，反应3～6小时制得活化的琼脂糖微球。

2)将1M的氢氧化钠、0.1～0.3g/mL的葡聚糖水溶液和步骤1)制得的活化的琼脂糖微球按体积比0.3～0.9:1:1混合，在反应温度为25～37℃的条件下，反应5～10小时，得到葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球。

3)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和步骤2)制得的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球按体积比0.1～0.5:0.4～0.8:1进行混合，在反应温度为25～70℃的条件下，反应3～6小时，制得活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。

4)步骤3)反应结束后，立即用1mM的盐酸进行中和，然后用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。

5)将步骤4)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与1M的碳酸钠溶液以体积比1:1或1:2混合后，加入L-天门冬氨酸至终浓度为0.1M～0.3M，在50～60℃下反应5～10小时后，用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质至中性。

6)将步骤5)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与0.1M的碳酸钠溶液按体积比2:1或1.5:1混合，加入溴乙酸至终浓度为0.3M～0.6M，在25～30℃下反应5～12小时后，用蒸馏水冲洗介质至中性。

7)将步骤6)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与100mM的硫酸镍溶液等体积混合室温反应2～3小时后，用蒸馏水冲洗介质至介质颜色不再变化，流出液中无镍离子为止，得到镍金属层析介质。

上述步骤1)～3)和步骤5)～6)中的反应均在摇床上震荡反应。

上述步骤2)中的葡聚糖分子量为4000。

本发明中，优选的一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，包括如下步骤：

1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.2:0.8:1进行混合，在反应温度为40℃的条件下，反应3小时制得活化的琼脂糖微球。