[发明专利]基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.1～0.5:0.5～0.9:1进行混合，在反应温度为25～70℃的条件下，反应3～6小时制得活化的琼脂糖微球；

2)将1M的氢氧化钠、0.1～0.3g/mL的葡聚糖水溶液和步骤1)制得的活化的琼脂糖微球按体积比0.3～0.9:1:1混合，在反应温度为25～37℃的条件下，反应5～10小时，得到葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球；

3)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和步骤2)制得的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球按体积比0.1～0.5:0.4～0.8:1进行混合，在反应温度为25～70℃的条件下，反应3～6小时，制得活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质；

4)步骤3)反应结束后，立即用1mM的盐酸进行中和，然后用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质；

5)将步骤4)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与1M的碳酸钠溶液以体积比1:1或1:2混合后，加入L-天门冬氨酸至终浓度为0.1M～0.3M，在50～60℃下反应5～10小时后，用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质至中性；

6)将步骤5)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与0.1M的碳酸钠溶液按体积比2:1或1.5:1混合，加入溴乙酸至终浓度为0.3M～0.6M，在25～30℃下反应5～12小时后，用蒸馏水冲洗介质至中性；

7)将步骤6)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与100mM的硫酸镍溶液等体积混合室温反应2～3小时后，用蒸馏水冲洗介质至介质颜色不再变化，流出液中无镍离子为止，得到镍金属层析介质。

2.如权利要求1所述的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：所述步骤1)～3)和步骤5)～6)中的反应均在摇床上震荡反应。

3.如权利要求1所述的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的葡聚糖分子量为4000。

4.如权利要求1或2或3所述的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.2:0.8:1进行混合，在反应温度为40℃的条件下，反应3小时制得活化的琼脂糖微球；

2)将1M的氢氧化钠、0.3g/mL的葡聚糖水溶液和步骤1)制得的活化的琼脂糖微球按体积比0.8:1:1混合，在反应温度为25℃的条件下，反应10小时，得到葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球；

3)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和步骤2)制得的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球按体积比0.4:0.8:1进行混合，在反应温度为40℃的条件下，反应3小时，制得活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质；

4)步骤3)反应结束后，立即用1mM的盐酸进行中和，然后用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质；

5)将步骤4)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与1M的碳酸钠溶液以体积比1:1混合后，加入L-天门冬氨酸至终浓度为0.3M，在60℃下反应10小时后，用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质至中性；

6)将步骤5)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与0.1M的碳酸钠溶液按体积比2:1混合，加入溴乙酸至终浓度为0.6M，在25～30℃下反应12小时后，用蒸馏水冲洗介质至中性；

7)将步骤6)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与100mM的硫酸镍溶液等体积混合室温反应3小时后，用蒸馏水冲洗介质至介质颜色不再变化，流出液中无镍离子为止，得到镍金属层析介质。

5.一种如权利要求1～4任一项制得的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的应用，其特征在于：将制得的镍金属层析介质与含有重组蛋白的菌株破碎后的上清液混合进行亲合吸附，然后利用不同咪唑浓度的PBS溶液对镍金属层析介质进行洗脱，收集每个浓度的洗脱液。

6.如权利要求5所述的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的应用，其特征在于：所述PBS溶液的咪唑浓度为25mM和150mM。