[发明专利]霍乱弧菌荧光PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中霍乱弧菌（O1群和O139群）核酸的试剂盒，属于霍乱弧菌的体外诊断领域。

背景技术

霍乱弧菌（Vibriocholerae）是革兰氏阴性菌，菌体如弧状，一端有鞭毛；霍乱弧菌有耐热的O抗原，根据O抗原的不同，分成139个血清型，其中O1群和O139型能引起霍乱流行。

霍乱主要为小肠疾患，人是霍乱弧菌的唯一易感者，经口感染，通过胃到达小肠，借助鞭毛的运动穿透粘膜层，依靠菌毛等黏附因子黏附于黏膜细胞表面，在此繁殖并产生霍乱肠毒素。

霍乱肠毒素致病机理如下：毒素由A和B两个亚单位组成，A亚单位又分为A1和A2两个肽链，两者依靠二硫键连接；A亚单位为毒性单位，其中A1肽链具有酶活性，A2肽链与B亚单位结合参与受体介导的内吞作用中的转位作用；B亚单位为结合单位，能特异地识别肠上皮细胞上的受体；1个毒素分子由一个A亚单位和4-6个B亚单位组成多聚体。霍乱肠毒素作用于肠细胞膜表面上的受体（由神经节苷脂GM1组成），其B亚单位与受体结合，使毒素分子变构，A亚单位进入细胞，A1肽链活化，进而激活腺苷环化酶（AC），使三磷酸腺苷（ATP）转化为环磷酸腺苷（cAMP），细胞内cAMP浓度增高，导致肠粘膜细胞分泌功能大为亢进，使大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈吐泻，由于大量脱水和失盐，可发生代谢性酸中毒，血循环衰竭，甚至休克或死亡。

在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测特异性和敏感性的基础。

本发明分别针对霍乱弧菌O1群和O139群基因序列的保守区域特异的靶序列设计引物和Taqman探针，利用real-timePCR的方法，用来快速检测样品中是否存在霍乱弧菌O1群和O139群的核酸。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是快速准确地检测样品中是否存在霍乱弧菌（O1群和O139群），提供一种特异性检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种特异性检测样品中霍乱弧菌核酸的试剂盒，包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg²⁺和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为无RNase和DNase水，阳性质控品为含O1和O139群霍乱弧菌特异性扩增位点的重组质粒。

PCR反应液中用于核酸扩增的引物为P1和P2，P1-1和P1-2为针对霍乱弧菌O1群基因组特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物，P2-1和P2-2为针对霍乱弧菌O139群基因组特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物；PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为Probe1、2，Probe1为针对霍乱弧菌O1群基因组特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，Probe2为针对霍乱弧菌O139群基因组特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，其中Probe1荧光报告基团X₁为FAM，荧光淬灭基团Y₁为Eclipse，Probe2荧光报告基团X₂为CY5，荧光淬灭基团Y₂为BHQ（见表1）。

表1检测霍乱弧菌的引物和探针序列

本发明的另一个目的是提供本荧光PCR检测试剂盒在检测霍乱弧菌的应用方法，包括：

试剂盒选用的PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10μl、10mmol/LdNTP1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针0.2μl、热启动Taq酶混合液0.4μl、样品DNA2μl，加灭菌水至终体系20μl。

试剂盒的PCR反应循环参数为94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，共反应40个循环。

质量控制：每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无Ct值（或Ct值为0），阳性对照Ct值≤30，否则实验结果不成立。

结果判读：