[发明专利]耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶HJ5nag及其制备方法

说明书

本发明公开了一种耐产物抑制的β‑N‑乙酰葡糖胺酶及其制备方法，所述β‑N‑乙酰葡糖胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述方法包括：首先用包含β‑N‑乙酰葡糖胺酶基因hJ5nag的重组载体，重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；然后培养重组菌株，诱导重组β‑N‑乙酰葡糖胺酶HJ5nag表达；最后回收所表达的β‑N‑乙酰葡糖胺酶HJ5nag。本发明的β‑N‑乙酰葡糖胺酶，最适pH6；最适温度为45℃；可催化水解几丁寡糖；在反应体系加入终浓度20mM N‑乙酰‑D‑胺基葡萄糖时，该酶仍保留约69.5％活性；可与内切几丁质酶协同降解几丁质，可应用于海产品加工、医学、功能性食品等行业。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶及其制备方法。

背景技术

几丁质是由N-乙酰-D-胺基葡萄糖单体通过β-1,4键组成的多糖，广泛存在于真菌、昆虫细胞壁以及甲壳类动物外骨骼中，其含量仅次于纤维素，因此几丁质的水解具有重要的意义。内切几丁质酶可以把几丁质降解为几丁寡糖，而β-N-乙酰葡糖胺酶可催化几丁寡糖降解为N-乙酰-D-胺基葡萄糖，因而β-N-乙酰葡糖胺酶对几丁质的完全水解起到关键性的作用；同时，由于内切几丁质酶会被几丁寡糖抑制，所以β-N-乙酰葡糖胺酶可解除几丁寡糖对内切几丁质酶的抑制作用，从而与内切几丁质酶产生协同作用(Yang et al.,Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62:5181–5190)。但是，大多数β-N-乙酰葡糖胺酶易受到水解产物即N-乙酰-D-胺基葡萄糖的抑制，需要耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶才能使几丁质更有效地彻底水解(Yang et al.,Journal of Agriculturaland Food Chemistry,2014,62:5181–5190)。根据氨基酸序列同源性，β-N-乙酰葡糖胺酶主要归类于糖苷水解酶第3、20、73和84家族(Cantarel et al.,Nucleic acids research,2009,37:D233–D238)。β-N-乙酰葡糖胺酶被广泛应用于功能性食品、保健品、化妆品、制药、饲料添加剂和生物杀虫剂等领域(Yang et al.,Journal of Agricultural and FoodChemistry,2014,62:5181–5190)。例如，β-N-乙酰葡糖胺酶水解几丁寡糖的产物N-乙酰-D-胺基葡萄糖单体具有抗炎作用，对于溃疡结肠炎和其他的胃肠炎症的治疗有很好的效果(Salvatore et al.,Alimentary pharmacology&therapeutics,2000,14:1567–1579)，N-乙酰-D-胺基葡萄糖也应用于治疗儿童慢性肠炎疾病以及骨关节炎(Shikhman et al.,Annals of the rheumatic diseases,2005,64:89–94)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶及其制备方法，旨在解决现有的β-N-乙酰葡糖胺酶易受到水解产物即N-乙酰-D-胺基葡萄糖的抑制从而导致几丁质水解效率较低的问题。

本发明是这样实现的，一种耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶，所述耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶总共含535个氨基酸，理论分子量为55.89kDa，其中N端有25个氨基酸为预测信号肽序列MNRRRGRAIAAATVLAASLAGCSPA，成熟的β-N-乙酰葡糖胺酶HJ5nag含510个氨基酸。

本发明的另一目的在于提供一种所述耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的制备方法，所述耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的制备方法包括以下步骤：

首先用包含β-N-乙酰葡糖胺酶基因hJ5nag的重组载体，重组载体为pEasy-E2-hJ5nag，将乙酰葡糖胺酶基因插入到表达载体中，使核苷酸序列与表达调控序列相连接，重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；