[发明专利]一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体是涉及一种体外扩增脐血CD34+细胞 的方法。

背景技术

自1989年世界上首例脐血移植成功以来，人们己经对脐血移植进行了深入 广泛的研究。但到目前为止，脐血移植仍存在一些尚待解决的问题，主要在于 脐血造血干/祖细胞(CD34+)数量少，使其目前主要应用于儿童患者，限制了 其广泛应用。因此，如何扩増脐血造造血干/祖细胞数量提高其植入率，缩短造 血重建恢复时间，己经成为目前人们对脐血移植研究的主要问题。

对脐血CD34+细胞的体外扩増，最初主要通过体外加入不同组合的细胞因 子来达到扩増的目的，但体外加入的细胞因子不能长期维持细胞的培养，需要 不断加以补充。之后，又建立了以骨髓基质细胞为滋养层的脐血CD34+细胞体 外扩増共培养体系，模拟体内造血微环境，以长期持续地分泌细胞因子来维持 脐血CD34+细胞的扩増。然而，人骨髓基质细胞来源受限且脐血CD34+细胞与成 人骨髓CD34+细胞具有不同的生物学特性。

因此，如何扩増脐血造造血干/祖细胞数量,提高其植入率，缩短造血重建 恢复时间，己经成为目前人们对脐血移植研究的主要问题。

发明内容

本发明解决的技术问题是针对以上不足，提供一种体外扩增脐血CD34+细 胞的方法，为脐血CD34+细胞的的扩增建立适合的培养条件，提高其植入率， 缩短造血重建恢复时间。

本发明的技术方案是，一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法，包括以下步 骤：

(1)脐血的采集及预处理：

无菌条件下从正常分娩足月新生儿胎盘抽取脐带血30～50ml,加入肝素抗 凝，以新生儿血清或成人的血清做为预处理的媒介，将脐带血与新生儿血清或 成人的血清按照1:1.5d的比例混匀，-15℃冷藏30分钟；

(2)脐血的分离：

预处理后的脐带血与Hank's液按体积比例为2:1混合，取一100ml离心 管，加入Ficoll-Paque分离液15～25ml，将脐带血混合液30～50ml缓慢加于 分离液上，1800r/min,离心16～20min，离心结束后，离心管中液体分层，吸 取白色雾状单个核细胞层到一新100ml离心管中；

(3)脐血CD34+细胞的纯化：

用红细胞裂解液(ACKLysisBuffer)除去红细胞，再用PBS清洗单核细胞 2～3次，计数，按1×10⁷个细胞/ml的密度接种到含培养基Ⅰ的75cm²培养瓶 中；使用磁性细胞分选仪和CD34+细胞分选试剂盒分离和纯化CD34+细胞；

(4)脐血CD34+细胞体外扩增培养：

脐血CD34+细胞重悬于培养基Ⅱ中，按1×10⁶/ml接种于6孔板中，每孔 2.5ml,在37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养4周，每周半量换液一次；

(5)测定CD34+扩増的细胞的造血祖细胞集落(CFC)形成能力：

吸取足量的培养基Ⅲ到注射器中，并分装到灭菌试管中,按1:10(v/v)的比 例将细胞添加到培养基Ⅲ中,扭紧试管盖,振摇试管，以保证所有的成份充分混 匀,用IMDM+2％FBS稀释至合适浓度,在6孔培养板中每孔接种2×10³个细胞， 37℃，5％C〇₂和饱和湿度条件下培养培养2周，在倒置显微镜下直接计数， 40个以上细胞为1个集落。

进一步地，所述培养基Ⅰ是由基础培养基和添加成分组成，所述基础培养 基为RPMI1640培养液，所述添加成分为：谷氨酰胺1～2.5ug/mL、β-巯基乙 醇1％(v/v)、碳酸氢钠2～3.5ug/mL、胰岛素1～5ug/mL、bFGF15～ 18ng/mL、维生素C30～50ug/mL。