[发明专利]一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法

权利要求书

1.一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)脐血的采集及预处理：

无菌条件下从正常分娩足月新生儿胎盘抽取脐带血30～50ml,加入肝素抗 凝，以新生儿血清或成人的血清做为预处理的媒介，-15℃冷藏30分钟；

(2)脐血的分离：

预处理后的脐带血与Hank's液按体积比例为2:1混合，取一100ml离心 管，加入Ficoll-Paque分离液15～25ml，将脐带血混合液30～50ml缓慢加于 分离液上，1800r/min,离心16～20min，离心结束后，离心管中液体分层，吸 取白色雾状单个核细胞层到一新100ml离心管中；

(3)脐血CD34+细胞的纯化：

用红细胞裂解液除去红细胞，再用PBS清洗单核细胞2～3次，计数，按 1×10⁷个细胞/ml的密度接种到含培养基Ⅰ的75cm²培养瓶中；使用磁性细胞分 选仪和CD34+细胞分选试剂盒分离和纯化CD34+细胞；

(4)脐血CD34+细胞体外扩增培养：

脐血CD34+细胞重悬于培养基Ⅱ中，按1×10⁶/ml接种于6孔板中，每孔 2.5ml,在37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养4周，每周半量换液一次；

(5)测定CD34+扩増的细胞的造血祖细胞集落(CFC)形成能力：

吸取足量的培养基Ⅲ到注射器中，并分装到灭菌试管中,按1:10(v/v)的比 例将细胞添加到培养基Ⅲ中,扭紧试管盖,振摇试管，以保证所有的成份充分混 匀,用IMDM+2％FBS稀释至合适浓度,在6孔培养板中每孔接种2×10³个细胞， 37℃，5％C〇₂和饱和湿度条件下培养培养2周，在倒置显微镜下直接计数。

2.如权利要求1所述的一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法，其特征在 于，所述培养基Ⅰ是由基础培养基和添加成分组成，所述基础培养基为 RPMI1640培养液，所述添加成分为：谷氨酰胺1～2.5ug/mL、β-巯基乙醇1％ (v/v)、碳酸氢钠2～3.5ug/mL、胰岛素1～5ug/mL、bFGF15～18ng/mL、维 生素C30～50ug/mL。

3.如权利要求1所述的一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法，其特征在 于，所述培养基Ⅱ配方如下：50～120ml胎牛血清、10～25ml非必需氨基 酸，1ml谷氨酰胺、2～8μlβ-巯基乙醇、1.0～1.5ml胰岛素、1～4μlN-乙 酰-L-半胱氨酸、3～20μg细胞因子GM-CSF(购于美国PeproTech公司)、1～ 5μg肥大细胞生长因子(MGF)、0.2～1.0μg粒细胞-集落刺激因子(G- CSF)、0.3～2.0μg白细胞介素8、重组人白介素-11。

4.如权利要求1所述的一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法，其特征在 于，所述培养基Ⅲ是在MethoCult培养基的基础上加入重组细胞因子，所述重 组细胞因子包括：G-CSF50ng/ml、IL-1110ng/ml、IL-1β10ng/ml、 EPO6U/ml。