[发明专利]细菌超氧化物歧化酶及其制备方法

说明书

本发明涉及一种细菌超氧化物歧化酶及其制备方法，所述细菌超氧化物歧化酶由保藏编号为CCTCC M 2015633的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)发酵培养制备得到，包括格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)的活化、种子液的制备、发酵培养以及超氧化物歧化酶的制备的步骤。该方法制备得到的超氧化物歧化酶产量高、活性好、稳定性好，制备过程简单、成本低。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种细菌超氧化物歧化酶及其制备方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是生物体防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶，它可以催化超氧阴离子的歧化反应产生分子氧和过氧化氢。超氧阴离子与人类及动植物的许多疾病的发生和形成有关。因此，SOD作为一种专一性的氧自由基清除剂，可以防御超氧阴离子的毒性，维持细胞正常的生理代谢，对机体具有保护作用。超氧化物歧化酶在医药、食品、化妆品、农业方面有着广阔的应用前景，因此受到国内外普遍重视。

SOD广泛存在于动物、植物、所有好氧微生物及少数厌氧微生物体内。目前SOD主要从动物组织中提取，比如牛肝和红细胞等，产量受到很大限制，且容易受到原料来源、安全性及质量不稳定等因素的影响；微生物来源广，繁殖快，时间短，易培养，用来制备SOD具有很大潜力。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种细菌超氧化物歧化酶的制备方法。

实现上述目的的具体技术方案如下。

一种细菌超氧化物歧化酶的制备方法，该细菌超氧化物歧化酶包括酶液和酶粉两种形式，由保藏编号为CCTCC M 2015633的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)发酵培养制备得到，包括以下步骤：

(1)格氏乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)在琼脂-M17培养基上活化；

(2)格氏乳球菌种子液的制备：将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于液体培养基中培养得到格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液；

(3)格氏乳球菌的发酵培养：将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液接种于发酵培养基中发酵培养后，离心收集发酵湿菌体直接用于下一步超氧化物歧化酶的制备，或者将离心收集的发酵湿菌体冻干得到冻干菌粉；

(4)超氧化物歧化酶的制备：将步骤(3)收集的发酵湿菌体或者冻干菌粉，悬浮于pH为7.2-8.5的磷酸缓冲液中，加入溶菌酶裂解2～24h，离心，将上清液调节pH为4.0～5.6，冰冷放置1-3h，离心除沉淀，即得细菌超氧化物歧化酶酶液；或将酶液冻干即得细菌超氧化物歧化酶酶粉。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述的发酵培养基的成分为：0.1～10wt％的碳源，0.1～10wt％的氮源，0～5wt％氮源以外的无机盐，余量为蒸馏水。

在其中一些实施例中，所述碳源选自单糖、双糖、多糖、酵母浸膏、蛋白胨、牛肉膏；所述氮源选自酵母浸膏、蛋白胨、无机铵盐、无机硝酸盐、尿素、玉米浆、豆饼粉；所述氮源以外的无机盐选自磷酸盐、钠盐、镁盐、锰盐、钙盐。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述琼脂-M17培养基中的琼脂含量为1～2wt％，活化的时间为12h～60h，活化的温度为20℃～45℃。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述液体培养基为M17肉汤培养基，培养的时间为12h～196h，培养的温度为20℃～45℃，培养的转速为0rpm～280rpm。