[发明专利]一种食品致病菌PCR扩增产物的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及致病菌检测，尤其是涉及一种致病菌PCR扩增产物的快速检测方法。

背景技术

食品是人类赖以生存的根本基础，食品安全则关乎广大人民群众的身体健康和生 命安全，频频爆发的食品安全事件不仅给人民群众的身体健康构成了严重威胁，而且也给 消费者和食品相关产业造成了巨大的经济损失，给社会、经济、政治的稳定和国家形象带来 不利的影响。灵敏高效的食品安全检测技术在保障食品安全、尤其是致病菌导致的食源性 疾病控制中具有至关重要的作用，根据美国农业部经济研究局的统计结果显示，沙门氏菌、 致病性大肠杆菌、弯曲杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌及毒素、致病性蜡样芽胞杆菌、产气荚 膜梭菌、变形杆菌属、李斯特菌、志贺氏菌等几类重要的细菌会造成巨大的经济损失，而志 贺氏菌具有高度传染性，是引起感染性腹泻的主要致病菌之一；致病性蜡样芽胞杆菌多存 在于蛋白质和碳水化合物丰富的米饭及肉类食品中，可引起腹泻综合征及呕吐综合征。人 们在食用被上述这些细菌污染的食物后，可引起腹泻、恶心、呕吐，严重者可致腹痛、出血性 肠炎及尿毒综合征甚至死亡。因此，食品安全性检测与评价逐步受到我国及其他国家的重 视与关注。

针对食品微生物污染的现状，各国已经发展和衍生了多种食品微生物检测技术， 目前，主要的几种快速检测技术包括实时荧光PCR法、荧光免疫检测法、基于PCR基础的凝胶 电泳法等，但上述方法均有应用范围的局限性，实时荧光PCR法检测成本高，对致病菌的检 测范围小；基于PCR基础的凝胶电泳法操作繁琐，易引起污染。因此，寻找和建立一种快速、 高效、准确的食品微生物的检测方法十分重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、灵敏度和特异性高的食品致 病菌PCR产物的快速检测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种食品致病菌PCR扩增产物的 快速检测方法，包括以下步骤：将待测食品致病菌PCR扩增产物中加入50μM的血晶素溶液 后，于37℃反应10min后形成G-四联体，然后加入TMB显色液，在室温下孵育5-10min直至 溶液颜色变成蓝色，用0.16M的H₂SO₄溶液终止后，通过颜色变化确定待测样品中是否含有 食品致病菌，其中所述的待测食品致病菌PCR扩增正向引物或者反向引物的5’端链接有辣 根过氧化酶互补序列，所述的辣根过氧化酶互补序列的基因序列为 AAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCCAAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCCAAAAA。

所述的待测食品致病菌PCR扩增产物、所述的血晶素溶液、所述的TMB显色液与所 述的H₂SO₄溶液的体积比为5：1：4：25。

所述的TMB显色液的配方为8μLHEPES缓冲液，4μL500mM的KCl溶液，4μLH₂O₂。

所述的待测食品致病菌PCR扩增体系中致病菌DNA模板采用磁珠法提取，具体步 骤如下：

（1）取1mL待测食品致病菌菌液，10000r/min离心5min，去上清，沉淀溶于1mL细菌 裂解液中，振荡15s，70℃水浴12min，以5000r/min离心，得到1mL细胞裂解清液；

（2）在1mL细胞裂解清液中加入10μL磁性纳米粒子，涡旋5s，然后再加入600μL吸附缓 冲液混匀，振荡反应15min，磁性分离去上清；

（3）用1mL70wt%乙醇溶液清洗MNPs两次，室温放置30min，使乙醇挥发完全；再加入50 μL洗脱缓冲液TE，混匀后静置10min，65℃水浴10min，磁分离，取上清，即为待测食品致 病菌DNA模板溶液，-20℃备用。OD260/280=1.8，相对于普通试剂盒的提取纯度提高了20%左 右。

所述的细菌裂解液的配方为50μL1M的Tris-HCl，50μL15wt%的SDS溶液，50μL 20mg/ml的蛋白酶k，20μL0.5M的pH=5.0的EDTA，2μLRNA酶，用双蒸水补足至1mL；所述的吸 附缓冲液的由80μL9wt%的聚乙二醇20000溶液和500μL的5M的NaCl溶液混合而成；所述 的洗脱缓冲液TE的配方成分为10mM的Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0。