[发明专利]一种TGEV S2基因重组杆状病毒的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种TGEVS₂基因重组杆状病毒的构建方法及其应用。

背景技术

猪传染性胃肠炎(Porcinetransmissiblegastroenteritis，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Porcinetransmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床症状的高度传染性疾病，主要侵害2周龄以内的仔猪，死亡率高达100％，各阶段的猪都易感，给养猪业造成了不可估量的损失。五、六十年代该病开始在我国有相关报道，近年来我国各个地方时有该病发生。当前还没有特别有效的药物来医治该病，主要依靠接种疫苗来进行防控。TGEV主要是通过消化道粘膜和呼吸道粘膜感染易感猪群，可见肠道粘膜免疫诱导的SIgA能够有效抵御TGEV感染。因此，研究一种有效刺激机体免疫系统产生粘膜免疫应答的新型疫苗，对TGE的防治具有重要意义。TGEVS蛋白具有主要的B淋巴细胞抗原决定簇，唯一诱导机体产生中和抗体并提供免疫保护作用的；且S蛋白含有宿主细胞氨肽酶受体(pAPN)的识别位点。因此在研究TGEV基因工程疫苗时将S基因作为首选靶基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种TGEVS₂基因重组杆状病毒的构建方法及其应用，旨在以杆状病毒为载体，表达TGEV主要抗原表位基因S₂，将重组杆状病毒口服和肌注免疫小鼠，检测小鼠粪便中的sIgA和血清中的IgG水平，试验结果初步证明重组杆状病毒可诱导小鼠产生粘膜免疫和体液免疫应答。

本发明是这样实现的，一种TGEVS₂基因重组杆状病毒的构建方法，所述TGEVS₂基因重组杆状病毒的构建方法包括：

S₂基因的扩增，用TGEV感染ST细胞，37℃培养48h，反复冻融，10000rpm/min离心10min，收集上清，利用RNAisoplus方法提取病毒总RNA，按照体系进行扩增；

重组转移载体的构建，将回收的S₂基因和pFastBac^TMDual质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后连接，S₂基因定向克隆于pFastBac^TMDual的Ph启动子下游，构建重组转移载体pFastBac^TMDual-S₂，转化DH5α，经PCR鉴定，将初步鉴定为阳性的质粒进行测序，用DNAstar软件分析插入片段的正确性；

重组Bacmid质粒的构建与鉴定，取5μL重组供体质粒pFastBac^TMDual-S₂，将其转入E.coliDH10Bac感受态细胞，在含卡那霉素(50μg/ml)、庆大霉素(7μg/ml)、四环素(10μg/ml)、X-gal(100μg/ml)和IPTG(40μg/ml)的LB琼脂培养基上，37℃避光培养48h，挑取白色较大的单个菌落，培养过夜，按照PureLink^TMHiPurePlasmidDNAPurificationKits的操作手册提取穿梭质粒DNA，经PCR鉴定后，将阳性重组穿梭载体命名为Bacmid-S₂，用于转染sf9细胞；

重组杆状病毒的获得及鉴定，将鉴定为阳性的Bacmid-S₂利用CellfectinRⅡReagent转染sf9昆虫细胞，27℃，5％CO₂培养箱培养直至出现病变，收获细胞上清，进行PCR鉴定，将上清液在sf9昆虫细胞盲传3代，重组病毒命名为rBacmid-S₂；

SDS-PAGE检测，分别用rBacmid-S₂P3代毒、野生杆状病毒P3代毒感染Sf9细胞，27℃，5％CO₂培养箱培养72h，反复冻融，10000rpm/min离心约10min,分别收集上清液和沉淀，配制分离胶和浓缩胶。

进一步，所述TGEVS₂基因重组杆状病毒的构建方法选择一对M13通用引物：

S₂上游引物：5'-ACTGAATTCATGTCATTGAACACAACGGGT-3'，其5'端斜体下划线部分设计有EcoRⅠ酶切位点；