[发明专利]一种TGEV S2基因重组杆状病毒的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种TGEVS₂基因重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，所述TGEV S₂基因重组杆状病毒的构建方法包括：

S₂基因的扩增，用TGEV感染ST细胞，37℃培养48h，反复冻融， 10000rpm/min离心10min，收集上清，利用RNAisoplus方法提取病毒总RNA， 按照体系进行扩增；

重组转移载体的构建，将回收的S₂基因和pFastBac^TMDual质粒经EcoRⅠ和 SalⅠ双酶切后连接，S₂基因定向克隆于pFastBac^TMDual的Ph启动子下游，构 建重组转移载体pFastBac^TMDual-S₂，转化DH5α，经PCR鉴定，将初步鉴定为 阳性的质粒进行测序，用DNAstar软件分析插入片段的正确性；

重组Bacmid质粒的构建与鉴定，取5μL重组供体质粒pFastBac^TMDual-S₂， 将其转入E.coliDH10Bac感受态细胞，在含卡那霉素(50μg/ml)、庆大霉素 (7μg/ml)、四环素(10μg/ml)、X-gal(100μg/ml)和IPTG(40μg/ml)的LB 琼脂培养基上，37℃避光培养48h，挑取白色较大的单个菌落，培养过夜，按照 PureLink^TMHiPurePlasmidDNAPurificationKits的操作手册提取穿梭质粒DNA， 经PCR鉴定后，将阳性重组穿梭载体命名为Bacmid-S₂，用于转染sf9细胞；

重组杆状病毒的获得及鉴定，将鉴定为阳性的Bacmid-S₂利用CellfectinRⅡ Reagent转染sf9昆虫细胞，27℃，5％CO₂培养箱培养直至出现病变，收获细胞 上清，进行PCR鉴定，将上清液在sf9昆虫细胞盲传3代，重组病毒命名为 rBacmid-S₂；

SDS-PAGE检测，分别用rBacmid-S₂P3代毒、野生杆状病毒P3代毒感染 Sf9细胞，27℃，5％CO₂培养箱培养72h，反复冻融，10000rpm/min离心约10min, 分别收集上清液和沉淀，配制分离胶和浓缩胶。

2.如权利要求1所述的TGEVS₂基因重组杆状病毒的构建方法，其特征在 于，所述TGEVS₂基因重组杆状病毒的构建方法选择一对M13通用引物：

S₂上游引物：5'-ACTGAATTCATGTCATTGAACACAACGGGT-3'，其5'端 斜体下划线部分设计有EcoRⅠ酶切位点；

S₂下游引物：5'-CGTGTCGACTAAGCCACTAAGTAGCGTCCT-3'，其5'端斜 体下划线部分设计有SalⅠ酶切位点；

M13上游引物：5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'；

M13下游引物：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'。