[发明专利]二聚探针同时检测樱桃绿环斑驳病毒和桃潜隐花叶类病毒的斑点杂交试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了二聚探针同时检测樱桃绿环斑驳病毒和桃潜隐花叶类病毒的斑点杂交试剂盒及检测方法。本发明所提供的用于同时检测樱桃绿环斑驳病毒和桃潜隐花叶类病毒的斑点杂交试剂盒，包含如下用于合成cRNA二聚探针的特异性引物：CGRMV‑F：AAGGCCTTTCGCCTCTGATGATACCGTC；CGRMV‑R：GGAATTCCACCCTTCTACTGGCTGCAAT；PLMVd‑F：GGAATTCCTGTGATCCAGGTACCGCCGTAGAAACT；PLMVd‑R：CTGGATCACACCCCCCTCGGAACCAACCGCT。本发明所制备的病毒和类病毒串联的cRNA二聚探针，能同时检测CGRMV和PLMVd，具有较好的灵敏性和特异性，可以一次检测大量样本，快速简单，大大节约成本，适用于果树田间样品的CGRMV和PLMVd的快速检测，有较大的应用潜力和实用价值。

技术领域

本发明涉及植物病毒检测领域，具体涉及二聚探针同时检测樱桃绿环斑驳病毒和桃潜隐花叶类病毒的斑点杂交试剂盒及检测方法。

背景技术

桃潜隐花叶类病毒(Peach latent mosaic viroid，PLMVd)属于Avsunviroidae科，主要侵染桃树、李、杏等核果类果树。1997年，Hadidi等报道PLMVd在欧洲、亚洲、北美和南美的桃种质中广泛分布(约为55％)(Hadidi,A,Giunchedi,L,Shamloul,AM,et al.,Occurrence of Peach latent mosaic viroid in stone fruits and its transmissionwith contaminated blades.Plant Disease,1997,81:154-158.)。PLMVd在桃树上潜隐期可达5～7年，症状一般表现为花叶、延迟发芽，严重时引起早衰、甚至死亡(Desvignes GC.Peach latent mosaic and its relation to Peach yellow mosaic virusdisease.Acta Horticulture,1986,193:51-57)。据报道，在我国辽宁、山东、河北、陕西，四川，湖北等地样品检测到PLMVd，有的果园桃树PLMVd发生普遍(张少瑜，张尊平，洪霓，等.桃潜隐花叶类病毒的鉴定.中国果树，2000，(1)：30-31.；刘晓,Barba M,Broggio M,et al.,四川核果类果树病毒类病害田间普查与检测鉴定.西南农业学报，2004，17(5)：613-617.；徐文兴，王国平，何云蔚，等.桃潜隐花叶类病毒中国分离株P3的克隆与序列分析.植物病理学报，2005，35(4)：300-304.；Yu,Y.,Zhao,Z.,Qin,L.,et al.,Incidence of major peachviruses and viroids in China.Journal of Plant Pathology,2013,95(3):603-607.)。樱桃绿环斑驳病毒(Cherry green ring mottle virus，CGRMV)是李属植物中发生较普遍，危害较严重的病毒之一。能侵染多种李属植物包括甜樱桃，酸樱桃，樱花，桃和杏(Zhang YP,Kirkpatrick B C,Smart C D,et al.cDNA cloning and molecular characterizationof Cherry green ring mottle virus.Journal of Gen Virol,1998,79:2275-2281.)。CGRMV属于线形病毒科(Flxeviiridae)凹陷病毒属(Foveavirus)(King A M Q,Adams M J,Carstens E B,et al.Virus taxonomy:classification and nomenclature of viruses:Ninth report of the international committee on taxonomy of viruses.ElsevierAcademic Press,San Diego,2011.)，该病毒在北美、欧洲、新西兰、非洲和亚洲等地区分布极广。2011年我国首次利用RT-PCR检测技术在甜樱桃和桃等李属植物中发现了CGRMV(ZhouJ F,Wang G P,Kuang R.F.,et al.First report of Cherry green ring mottle viruson cherry and peach grown in China.Plant Disease,2011,95(10):1319.)。王文文等(王文文，宗晓娟，陈立伟，等.山东地区樱桃绿环斑驳病毒(CGRMV)的RT-PCR检测及外壳蛋白基因的克隆.山东农业大学学报(自然科学版)，2012，43(2)：206-210，219.)对山东地区甜樱桃生产园进行病原检测，发现CGRMV发生较普遍。近年来，我们对我国主要桃产区病毒病进行了系统调查及RT-PCR分子检测，结果表明:分别在新疆，甘肃，福建，河南，云南，广西，河北，北京，山东等地桃树样品上均检测到PLMVd；在山东、福建和甘肃等地桃树样品上检测到CGRMV(Yu,Y.,Zhao,Z.,Qin,L.,et al.,Incidence of major peach viruses andviroids in China.Journal of Plant Pathology,2013,95(3):603-607.)。2013年6月我们对福建不同果园桃树43个显症和不显症的样品进行了6种主要病毒:苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus，ACLSV)，李属坏死环斑病毒(Prunus necroticringspot virus，PNRSV)，CGRMV，杏假褪绿叶斑病毒(APCLSV)，李树皮坏死与茎痘伴随病毒(Plum bark necrosis stem pitting-associated virus，PBNSPaV)，白蝶兰(属)花叶病毒(Pecteilis mosaic virus，PcMV)，2种类病毒(PLMVd和啤酒花矮化类病毒(Hop stuntviroid，HSVd)检测，43个样品中只检测到PLMVd，HSVd和CGRMV三种病原，而且，CGRMV主要是与PLMVd复合侵染为主，复合侵染率较高。