[发明专利]二聚探针同时检测樱桃绿环斑驳病毒和桃潜隐花叶类病毒的斑点杂交试剂盒及检测方法

权利要求书

1.二聚探针同时检测樱桃绿环斑驳病毒和桃潜隐花叶类病毒的斑点杂交试剂盒，其特征在于：包含如下用于合成cRNA二聚探针的特异性引物：

CGRMV-F：AAGGCCTTTCGCCTCTGATGATACCGTC；

CGRMV-R：GGAATTCCACCCTTCTACTGGCTGCAAT；

PLMVd-F：GGAATTCCTGTGATCCAGGTACCGCCGTAGAAACT；

PLMVd-R：CTGGATCACACCCCCCTCGGAACCAACCGCT。

2.同时检测樱桃绿环斑驳病毒和桃潜隐花叶类病毒的cRNA二聚探针，其特征在于：所述cRNA二聚探针的序列如序列表中序列8所示。

3.同时检测樱桃绿环斑驳病毒和桃潜隐花叶类病毒的cRNA二聚探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)使用权利要求1所述的特异性引物CGRMV-F和CGRMV-R通过RT-PCR扩增得到所述樱桃绿环斑驳病毒的PCR扩增产物，纯化回收后克隆到质粒载体上，得到重组质粒Ι；同时使用权利要求1所述的特异性引物PLMVd-F和PLMVd-R通过RT-PCR扩增得到所述桃潜隐花叶类病毒的PCR扩增产物，纯化回收后克隆到质粒载体上，得到重组质粒Π；

(2)对所述步骤(1)得到的所述重组质粒Ι和重组质粒Π分别使用权利要求1所述的特异性引物CGRMV-F和CGRMV-R及PLMVd-F和PLMVd-R通过RT-PCR进行再次PCR扩增，PCR扩增片段分别用限制性内切酶EcoI进行酶切和串联，亚克隆到新的质粒载体上形成CGRMV和PLMVd串联片段的重组质粒Ⅲ；

(3)以所述步骤(2)合成的重组质粒Ⅲ为模板，按照地高辛标记试剂盒说明书通过体外转录制备得到CGRMV+PLMVd-cRNA二聚探针。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

所述质粒载体为pGEM-T载体；所述重组质粒Ι为重组质粒pG-CGRMV；所述重组质粒Π为重组质粒pG-PLMVd；所述重组质粒Ⅲ为重组质粒pG-CGRMV+PLMVd。

5.同时检测樱桃绿环斑驳病毒和桃潜隐花叶类病毒的斑点杂交方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的总RNA，得到RNA提取物；

(2)将所述RNA提取物经甲醛变性后，点到杂交膜上；

(3)使用权利要求1所述的斑点杂交试剂盒或权利要求2所述的cRNA二聚探针进行杂交检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述步骤(1)中所述提取待测样品的总RNA的方法为CTAB提取法；

所述步骤(2)中所述经甲醛变性的方法为：5μlRNA加3μl 37％甲醛+2μl 20×SSC，混匀后于60℃保温20min，置于冰上5min；

所述步骤(3)中所述杂交的温度为60℃，杂交时间16h。

7.用于检测樱桃绿环斑驳病毒的斑点杂交试剂盒，其特征在于：包含如下用于合成cRNA单聚探针的特异性引物：

CGRMV-F：AAGGCCTTTCGCCTCTGATGATACCGTC；

CGRMV-R：GGAATTCCACCCTTCTACTGGCTGCAAT。

8.检测樱桃绿环斑驳病毒的cRNA单聚探针，其特征在于：所述cRNA单聚探针的序列如序列表中序列5所示。