[发明专利]一种极速获得分生孢子的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物科学领域，特别涉及一种极速获得分生孢子的方法。

背景技术

冬虫夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sunget et al.]是我国青藏高原特产的传统名贵中药材，它是冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科蝙蝠蛾属昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。近年来，随着冬虫夏草营养及药用价值认识的普及，加之人们生活水平不断提高，对冬虫夏草的需求不断增大，导致乱采滥挖不断加剧，资源破坏越来越严重，致使冬虫夏草资源锐减，人工培植冬虫夏草势在必行。由于现有技术存在幼虫染菌率低或染菌后存活率低等问题，一直制约着人工培植冬虫夏草规模化发展，多年的研究证实，中国被毛孢(H.sinensis)为冬虫夏草菌的无性型，分生孢子作为中国被毛孢生活史中极为重要的一个环节，在冬虫夏草侵染和形成过程中起着十分关键的作用，有研究表明采用中国被毛孢分生孢子来侵染蝙蝠蛾幼虫能够明显提高侵染率。

目前，常用的获得中国被毛孢分生孢子的方法有：固体发酵诱导和微循环产孢。

固体发酵诱导获得分生孢子的周期较长，一般为60～90天，导致培养过程中的染菌几率增加，且产量不稳定，受限于中国被毛孢菌株类型及固体培养基的优劣。

微循环产孢是真菌的孢子萌发后，不经过(或仅有极微弱的)菌丝生长阶段，直接从孢子上产生产孢结构和孢子。该方法产孢周期短多用于冬虫夏草菌无性型的鉴定，莫明和等在期刊《菌物系统》2001年第4期发表的文章“冬虫夏草的微循环产孢及其无性型的分离”中公开了在载玻片上加一滴萨氏培养基，将子囊孢子点接于培养基上进行微循环产孢，5天后产生分生孢子，根据分生孢子的显微特征对其进行鉴定，作者认为该方法简便可靠，具有很好的实用性。肖岩岩等在期刊《安徽农业大学学报》2011年38卷第1期发表的文章“冬虫夏草子囊孢子及其无性型在培养过程中的形态学观察”中将中国被毛孢分生孢子接入液体培养基，进行微循环产孢后，结合分子生物学技术手段将分离到的菌株鉴定为中国被毛孢。可见，传统的微循环产孢以培育出少量的分生孢子作为冬虫夏草菌无性型的鉴定为目的，并不追求分生孢子的产量，未对微循环产孢的环境温湿度和营养条件做深入的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种改良的微循环产孢的的方法，该方法不仅培养周期短、成本低，而且工艺稳定、产率高，为成功侵染蝙蝠蛾幼虫提供稳定的分生孢子来源。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种极速获得分生孢子的方法，将中国被毛孢子囊孢子溶液均匀涂抹于蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫 虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅的表面，分别置于垫有湿滤纸的培养皿内，在温度12～18℃，相对湿度60～90％，避光的无菌环境下培养24～96h，即得中国被毛孢分生孢子。对蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅表面进行洗脱，收集分生孢子。

一些实施例中，本发明所述的中国被毛孢子囊孢子溶液，包含具有保湿和粘附作用的溶剂，优选的为2～5％甘油水溶液。

一些实施例中，本发明所述的中国被毛孢子囊孢子溶液，孢子的浓度为4500～5500个/ml，优选的为5000个/ml。

一些实施例中，本发明所述的将中国被毛孢子囊孢子溶液均匀涂抹于蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅的表面，涂抹工具为柔性工具，不损伤幼虫，柔性工具可以是毛笔、布条、棉签等，优选的为毛笔。

一些实施例中，本发明所述的将中国被毛孢子囊孢子溶液均匀涂抹于蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅的表面，每个载体的涂抹量为15～25μl，优选的为20μl。

一些实施例中，本发明所述的将中国被毛孢子囊孢子溶液均匀涂抹于蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅的表面，蝙蝠蛾幼虫优选的为3～5龄的活的幼虫。

一些实施例中，本发明所述的垫有湿滤纸的培养皿，滤纸湿度控制为充分润湿，满盈但不溢出水分。每天检查，根据滤纸的水分状况进行补加水处理。

一些实施例中，本发明所述的培养环境，优选的为温度14～16℃，相对湿度65～85％，避光的无菌环境。

一些实施例中，本发明所述的对蝙蝠蛾幼虫体表、蝙蝠蛾幼虫虫蜕或蝙蝠蛾成虫翅表面进行洗脱，洗脱液优选的为含0.1％吐温80的0.003mol/l KH₂PO₄缓冲液。