[发明专利]一种胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分化的方法

说明书

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分化的方法。本发明将E‑cadherin基因作为外源基因转染胚胎干细胞，得到高效表达E‑cadherin基因的胚胎干细胞，然后培养分化，得到拟胚体，将其移植至含有EMT抑制剂的三维细胞培养系统中进行诱导培养，得到三维生长的肝脏组织结构。本发明首次从细胞黏附和EMT水平的角度研究ESC体外向肝脏组织结构分化，E‑cadherin转染后表达水平稳定控制，可保持细胞分化中足够的细胞黏附力，使其不易分散为单层细胞；降低胚胎干细胞体外分化过快的EMT水平，调控分化肝实质细胞以及肝间质细胞同步分化以形成肝脏组织，更加符合体内组织发育机理。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分化的方法。

背景技术

当今胚胎干细胞(ESC)向肝脏方向分化研究中，分化研究水平仍多限于单细胞状态，即仅能分化为肝细胞和胆管上皮细胞(BEC)等肝系细胞，缺点包括单一的细胞类型和不能进一步形成肝脏组织结构。现有技术也曾成功诱导胚胎干细胞向肝细胞和胆管上皮细胞分化，但分化细胞仍呈单细胞状态而很难形成肝组织。有学者研究改善胚胎干细胞分化的肝细胞状态，如通过聚氨酯支架等三维培养使分化肝细胞形成聚合体，但仅能改善其物理性态，不能形成包含肝细胞、胆管上皮细胞、血管结构等间质成分的真正意义上的肝脏组织。

作为功能复杂的器官组织，肝脏不仅需要肝细胞的合成代谢及解毒等功能，还需要胆管上皮的运输功能，以及其他间质细胞的细胞因子分泌和免疫调节等功能。如要在治疗中达到较全面的肝功能替代效果，仅靠获得数量和功能满意的单一的肝细胞是远远不够的，需要分化为由肝细胞、胆管上皮细胞、间质细胞、血管成分等组成的肝脏组织结构。

研究人员发现胚胎干细胞在体外向肝系细胞分化过程中，由单个胚胎干细胞首先分化发育为包含三胚层结构的拟胚体(embryonic body，EB)，再进而由拟胚体分化为包含肝系细胞的细胞群落。期间，拟胚体向细胞群落分化过程中，细胞间黏附力较体内胚胎发育时明显下降，从而很容易失去拟胚体的三维组织结构状态而逐渐变为单层的细胞分化群落，即只能分化为单层的肝细胞或胆管上皮细胞，而不能形成肝脏组织。同时，拟胚体在体外分化过程中，的细胞上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)速度(水平)过快(过高)，使得肝系细胞分化时程与肝脏间质成分如血管结构等分化时程脱节，因此在分化得到的肝细胞中间也缺乏血管间质成分，也就不能形成真正意义上的肝脏组织结构。

上皮型钙粘蛋白(Epithelial-cadherin,E-cadherin)是介导肝脏组织中细胞间黏附的主要黏附分子，通过介导肝细胞黏附而调控肝脏组织发育信号传导。分泌型卷曲相关蛋白-1(secreted frizzled-related proteins,sFRP-1)可通过下调Wnt/β-catenin信号而降低细胞培养中的EMT水平，减缓肝实质细胞和血管等肝脏间质细胞的分化时程，是二者分化达到同步，有利于分化出各种肝脏组织成分。

目前没有相关研究通过增强细胞黏附力和减缓细胞分化中EMT速度实现胚胎干细胞分化为真正意义上的肝脏组织结构。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分化的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分化的方法，包含如下步骤；

(1)将E-cadherin基因作为外源基因转染胚胎干细胞，得到高效表达E-cadherin基因的胚胎干细胞(E-cadherin-ESC)；

(2)将步骤(1)得到的高效表达E-cadherin基因的胚胎干细胞进行培养分化，得到包含三胚层结构的拟胚体(EB)；