[发明专利]一种胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分化的方法

权利要求书

1.一种胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分化的方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)将E-cadherin基因作为外源基因转染小鼠胚胎干细胞，得到高效表达E-cadherin基因的胚胎干细胞；

(2)将步骤(1)得到的高效表达E-cadherin基因的胚胎干细胞进行培养分化，得到包含三胚层结构的拟胚体；

(3)将步骤(2)得到的包含三胚层结构的拟胚体移植至含有EMT抑制剂的细胞培养系统中进行诱导培养，得到三维生长的肝脏组织结构；

步骤(3)中所述的EMT抑制剂为EMT抑制剂sFRP-1；

在胚胎干细胞分化第7～19天，即拟胚体转入细胞培养系统中开始，加入0.5μg/mL的sFRP-1；

步骤(3)中所述的细胞培养系统为半开放胶原支架颗粒三维培养系统；

所述的半开放胶原支架颗粒三维培养系统通过如下方法制备得到：对胶原支架颗粒进行切割，使其形成裂隙；得到半开放胶原支架颗粒三维培养系统；

步骤(3)中所述的拟胚体位于上述胶原支架颗粒切割后形成的裂隙中；

步骤(3)中所述的诱导培养过程中添加肝性生长因子；

所述的肝性生长因子加入时间和用量为：

胚胎干细胞分化第7天～19天，加入终浓度为30ng/mL的EGF和终浓度为30ng/mL的TGF；

胚胎干细胞分化第7天～10天，加入终浓度为20ng/mL的HGF；

胚胎干细胞分化第11～19天，加入终浓度为40ng/mL的HGF；

胚胎干细胞分化第15～19天，加入终浓度为10ng/mL的OSM，终浓度为10^-7M的地塞米松、终浓度为5μg/mL的胰岛素、终浓度为5μg/mL的转铁蛋白。

2.根据权利要求1所述的胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分化的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的转染的方法，包含如下操作：

将E-cadherin-cDNA全序列和真核细胞表达载体连接，得到含有E-cadherin-cDNA全序列和CAG启动子的重组载体，然后将重组载体转染胚胎干细胞并筛选阳性克隆胚胎干细胞，得到高效表达E-cadherin基因的胚胎干细胞。

3.根据权利要求1所述的胚胎干细胞向肝脏组织结构诱导分化的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的诱导培养的培养基由基础培养基和添加物组成；

所述的基础培养基为DMEM培养基；所述的添加物包含如下组分：体积分数为20％的胎牛血清、终浓度为0.1M的2-巯基乙醇、终浓度为25mM的HEPES、终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100μg/mL的链霉素。