[发明专利]一种百合定向活体转化液及其转化方法

说明书

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，特别涉及一种百合定向转化液，还涉及一种百合定向转化方法。

背景技术

百合是百合科百合属多年生草本球根植物，原产于中国，以其姣美的花姿与百年好合的寓意，深受人们的喜爱，尤其是在婚礼插花上，百合的应用更为普遍。

然而目前的百合品种已经不能满足人们的需求，百合自然突变概率不高且突变方向不可控，定向转基因技术可根据人们需求定向改造百合基因，培养新品种，满足人们的需求。但是常规转基因技术操作复杂、成本高、耗时长，不利于大规模转化。

发明内容

基于现有技术存在上述问题，本发明提供一种百合定向活体转化液及其转化方法，转化液由农杆菌工程菌液、SilwetL-77、蔗糖、乙酰丁香酮、吐温、蓝莓浸提液组成，转化方法包括以下步骤：转化液的制备、活体转化、农杆菌与花芽共培养、抗性花芽筛选、基因检测。本发明提供的技术方案具有操作简单、成本低、耗时短、转化率高的优点。

一种百合定向活体转化液，其由农杆菌工程菌液、SilwetL-77、蔗糖、乙酰丁香酮、吐温、蓝莓浸提液组成，SilwetL-77和吐温可增加农杆菌在花芽上的覆盖率，乙酰丁香酮与植物细胞壁上的特异单糖可协同诱导农杆菌的Ti质粒上的vir基因表达，促进农杆菌转化百合花芽。

农杆菌工程菌液为自行制备，将保存在-80℃的农杆菌工程菌划线培养于含卡那霉素的YEP培养基中，28℃暗培养2-3天，待菌落长出后挑取单菌落接种于50ml含有卡那霉素和利福平的YEP液体培养基中，于28℃、220r/min振荡培养至对数生长期即可制成农杆菌工程菌液，处于对数生长期的农杆菌活力最高，有利于提高转化成功率。

蓝莓浸提液为自行制备，将蓝莓与等体积水混合，榨汁，过滤灭菌即可制得蓝莓浸提液，蓝莓浸提液具有大量花青素，花青素为酚类物质，可聚集和引导农杆菌并促进转化过程，提高转化成功率。

SilwetL-77的体积浓度为0.03%-0.05%，吐温的体积浓度为0.03%-0.06%，蔗糖的浓度为200-400mg/L，乙酰丁香酮的浓度为18-20mg/L，蓝莓浸提液浓度为2-4ml/L。

一种百合定向活体转化方法，其包括以下步骤：

S010转化液的准备：向农杆菌工程菌液加入SilwetL-77、蔗糖、乙酰丁香酮、吐温和蓝莓浸提液、卡那霉素、利福平制成转化液；

S020活体转化：选取刚长出的花芽，控制花芽表层平均温度为20-23℃，向花芽洒上无菌水，保持其湿度为75%-80%，用医用注射器将花芽轻轻刺伤，并注射步骤S010配制的转化液；

S030农杆菌与花芽共培养：用浸泡过转化液的医用棉花覆盖转化后的花芽，并将转化植株置于温度为20-23℃、湿度为75%-80%的温室下培养3-5天；

S040抗性花芽筛选：在共培养结束后向花芽喷洒利福平和卡那霉素，筛选出成功转化并能正常分离分化的抗性花芽，将转化成功植株按常规百合栽培方法进行水肥管理；

S050基因检测：将抗性花芽进行基因检测，检测结果为阳性的即为转基因植株。

步骤S010转化液的制备中，在制备转化液前进行步骤S011农杆菌工程菌液基因检测，检测结果为阳性即可继续进行步骤S010转化液的制备。

步骤S011农杆菌工程液基因检测方法是PCR鉴定，还可以是GUS染色鉴定。

步骤S050基因检测所使用的检测方法是PCR鉴定，还可以是GUS染色鉴定。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述。

实施例一：一种百合定向转化液的制备。

从-80℃超低温冰箱中取出保存的农杆菌工程菌，划线培养于含100g/L卡那霉素的YEP培养基中，28℃暗培养2天，待菌落长出后，挑取单菌落接种于50ml含有100g/L卡那霉素和40g/L利福平的YEP液体培养基中，于28℃、220r/min振荡培养至OD₆₀₀值为0.8时，即农杆菌达到对数生长期，制成农杆菌工程菌液，备用。

向农杆菌工程菌液按相应浓度加入如下成分：

SilwetL-77，体积浓度为0.04%；吐温，体积浓度为0.05%；蔗糖，浓度为300mg/L；乙酰丁香酮，浓度为19mg/L；蓝莓浸提液，浓度为3ml/L。

将加入各成分的农杆菌工程菌液轻轻摇匀即成百合定向转化液，备用。