[发明专利]利用具有产生L-赖氨酸能力的微生物产生L-赖氨酸的方法

说明书

本申请是分案申请，原申请的申请日为2012年12月21日、申请号为201280070290.6、发明名称为“利用具有产生L-赖氨酸能力的微生物产生L-赖氨酸的方法”。

发明背景

1.发明领域

本发明涉及修饰的多核苷酸——其中起始密码子用ATG替代；包括其的载体；包括该多核苷酸的微生物；和利用其产生L-赖氨酸的方法。

2.相关技术的描述

棒状杆菌属的菌株,特别地谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，是广泛地用于产生L-赖氨酸的革兰氏阳性微生物。L-赖氨酸用于动物饲料、人的药物和化妆品，并通过棒状杆菌菌株的发酵产生。

常规地，具有提高的赖氨酸生物合成基因的棒状杆菌属的菌株和利用其产生L-赖氨酸的方法是已知的。例如，美国专利号6,746,855公开了通过培养具有增强的lysE基因(赖氨酸输出载体基因，lysineexportcarriergene)表达、并且另外引入选自dapA基因、lysC基因、pyc基因和dapB基因的基因的棒状杆菌而产生L-赖氨酸的方法。

另一个方法是扩增关于赖氨酸生物合成途径的基因以修饰启动子。例如，韩国专利申请特许公开号2009-0082702和2009-0084099公开了通过将改进的ddh启动子和lysC-asd操纵子引入棒状杆菌而产生L-赖氨酸的方法。韩国专利申请特许公开号2008-0025355公开了通过增加染色体中关于赖氨酸生物合成途径的基因——其是aspB、lysC、asd、dapA、dapB、lysA和pyc——的拷贝数而提高赖氨酸生产力的方法。

同时，由核糖体识别以启动染色体中翻译的起始密码子通常是ATG。翻译可根据基因的起始密码子而被控制，并且起始密码子的序列在蛋白质活性的调节中是重要的。然而，虽然ATG是源自谷氨酸棒状杆菌的赖氨酸生物合成基因中通常的起始密码子，但是lysC和pyc基因的起始密码子是GTG，并且TTG用于戊糖磷酸盐途径上的tkt基因，其含有起始密码子TTG(参考:J.Biotechnol.,104:5-

本发明人已作出许多努力来找到提高赖氨酸生产力的方法，结果，他们发现野生型lysC、tkt和pyc基因的起始密码子可用ATG替代以提高天冬氨酸激酶、转酮醇酶和丙酮酸羧化酶相对于其内源活性的活性，由此完成本发明。

发明概述

本发明的目的是提供编码天冬氨酸激酶(EC:2.7.2.4；在下文中，称作LysC)、转酮醇酶(EC:2.2.1.1；在下文中，称作Tkt)或丙酮酸羧化酶(EC:6.4.1.1；在下文中，称作Pyc)的修饰的多核苷酸，其中多核苷酸的起始密码子用ATG替代。

本发明的另一个目的是提供包括一种或多种编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的修饰的多核苷酸的载体，其中多核苷酸的起始密码子用ATG替代。

本发明的另一个目的是提供微生物，其中一种或多种酶具有与它们的内源活性相比提高的活性。

本发明的另一个目的是提供产生L-赖氨酸的方法，包括培养所述微生物，和从培养的微生物或培养肉汤回收L-赖氨酸的步骤。

发明效果

本发明提供具有提高的L-赖氨酸生产力的棒状杆菌属微生物，其中一种或多种编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的基因的起始密码子被替代，以与天然微生物中它们的内源活性相比提高相应的酶活性。

优选实施方式的详细描述

一方面，本发明提供编码天冬氨酸激酶(EC:2.7.2.4；在下文中，称作LysC)、转酮醇酶(EC:2.2.1.1；在下文中，称作Tkt)或丙酮酸羧化酶(EC:6.4.1.1；在下文中，称作Pyc)的修饰的多核苷酸，其中多核苷酸的起始密码子由ATG替代。

每个编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的多核苷酸还可包括多核苷酸中的部分替代、缺失、插入或添加，只要它们中的每个具有酶活性，和基于已知的多核苷酸可具有70％或更多的同源性，特别地80％或更多的同源性，更特别地90％或更多的同源性，和更特别地95％或更多的同源性，和最特别地100％同源性。