[发明专利]一种同时检测精子细胞凋亡及膜完整性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学临床上使用的检测方法，确切地说是一种同时检测精子细胞凋亡 及膜完整性的方法。

背景技术

精子膜完整性与精子代谢、顶体反应、精子获能及精卵融合密切相关，测定精子膜 是否完整可以准确地反映精子功能并预测精子潜在受精能力。自1984年建立精子尾部低渗 肿胀实验测定人精子膜功能以来，精子尾部低渗肿胀实验已成为目前不多的几个评价精子 膜功能的检测方法之一，越来越广泛地运用于男性生殖避孕的基础研究和不育的临床诊治 中。细胞的物质交换和新陈代谢活动依靠细胞膜进行，精子在男、女性生殖道中极易受到各 种化学物质影响，精子膜对这些物质的传递能力直接影响精子的活力和新陈代谢，从而关 系到能否获能，完成受精的全过程。因此，评价精子膜功能在精子功能检测中具有重要意 义。但是，单纯的精子低渗肿胀实验只能确定一个精子膜是否完整，而不能鉴别其DNA及染 色质是否完整（凋亡），如果仅单纯检测精子膜的完整性，而不检测精子凋亡还不能准确地 判断精子的活性，因此，现有的实验方法难以准确判断出同一条精子的膜及DNA及染色质是 否有损伤及凋亡，即难以对精子的质量作出精确的评价。

发明内容

本发明的目的，是提供了一种同时检测精子细胞凋亡及膜完整性的方法，它可解 决现上述技术存在的问题，其优点是可以同时显示同一条精子其膜是否完整及染色质是否 完整，并且用无毒性和致癌性的茯苓多糖液代替原有的4%多聚甲醛固定液，能使精子保持 上一步骤处理后的肿胀或不肿胀的形态，并可防止有害化学物对环境污染和对实验人员造 成损害。使用琼脂凝胶可使精子能够在载玻片上很好的铺开，使精子能够保持上步骤处理 后的肿胀或不肿胀形态不变，可辅助人们精确判断精子的质量。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种同时检测精子细胞凋亡及膜完整 性的方法，其特征在于：操作步聚如下：①制备低渗液：向每100毫升蒸馏水中放入735毫克 柠檬酸钠和1350毫克果糖制成低渗液，并使其离子强度为0.15（系数），渗透压150摩斯摩尔 的溶液；②向每1毫升步骤①中所述的低渗液中加入0.1毫升精液，混匀，在水温为37℃的 水中水浴30分钟后得低渗处理后精液，观察200个精子，计算尾部肿胀的精子比率；③取1毫 升步骤②中所述的低渗处理后精液，以1000转/分的离心机转速下离心处理5分钟，静置分 层后，弃上清液，所得精液用精子沉渣用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释到精子密度1000万个/毫 升，得稀释精液；④取步骤③中所述的稀释精液0.2毫升与琼脂凝胶按体积比1：1比例混匀， 放置在1.5毫升的离心管内，在室温37℃条件下孵育5分钟得配置精液；⑤吸取步骤④中所 述的配置精液50微升置入载玻片上，加盖盖玻片，在环境温度4℃的条件下放置4分钟；所述 载玻片是表面铺有一层薄薄的多聚赖氨酸的载玻片；⑥将步骤⑤所述的载玻片上的盖玻片 去除，将载玻片浸泡在茯苓多糖液中25分钟，以对载玻片上物质作固定处理；茯苓多糖液是 由每10毫升生理盐水中加入1克茯苓多糖配置而成；⑦用磷酸盐缓冲液（PBS）浸洗步骤⑥所 述固定后的载玻片二次，每次5分钟；然后将浸洗后载玻片在10毫升0.2%的TritonX-100中 浸洗处理5分钟，之后再用磷酸盐缓冲液浸洗二次，每次5分钟；⑧用50微升TdT和450微升 荧光素标记的dUTP液混匀制备混合液；将经步骤⑦处理后的数块载玻片分成阴性对照组和 阳性对照组，其中向阴性对照组的每块载玻片加50微升荧光素标记的dUTP液；阳性对照组 的每块载玻片先加入100微升DNase1，反应在15~25℃×10分钟，之后将每块载玻片在 0.2%的TritonX-100中处理，10毫升中浸洗5分钟，再用PBS浸洗二次，每次5分钟；阴性对照 组和阳性对照组的所有载玻片干后在暗湿盒中反应37℃×30分钟，PBS漂洗3次，每次5分 钟；暗湿盒是密闭避光、湿度在80%以上的盒子；⑨将步骤⑧最终处理后的所有载玻片加50 ~100微升二氨基联苯胺（DAB）底物，反应15~25℃×10分钟；⑩将步骤⑨处理后的载玻片用 苏木素或甲基绿复染，5秒后立即用自来水冲洗；梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封 片；在显微镜下观察结果。