[发明专利]一种同时检测精子细胞凋亡及膜完整性的方法

权利要求书

1.一种同时检测精子细胞凋亡及膜完整性的方法，其特征在于：操作步聚如下：

①制备低渗液：向每100毫升蒸馏水中放入735毫克柠檬酸钠和1350毫克果糖制成低渗 液，并使其离子强度为0.15（系数），渗透压150摩斯摩尔的溶液；

②向每1毫升步骤①中所述的低渗液中加入0.1毫升精液，混匀，在水温为37℃的水中 水浴30分钟后得低渗处理后精液，观察200个精子，计算尾部肿胀的精子比率；

③取1毫升步骤②中所述的低渗处理后精液，以1000转/分的离心机转速下离心处理5 分钟，静置分层后，弃上清液，所得精液用精子沉渣用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释到精子密度 1000万个/毫升，得稀释精液；

④取步骤③中所述的稀释精液0.2毫升与琼脂凝胶按体积比1：1比例混匀，放置在1.5 毫升的离心管内，在室温37℃条件下孵育5分钟得配置精液；

⑤吸取步骤④中所述的配置精液50微升置入载玻片上，加盖盖玻片，在环境温度4℃的 条件下放置4分钟；所述载玻片是表面铺有一层薄薄的多聚赖氨酸的载玻片；

⑥将步骤⑤所述的载玻片上的盖玻片去除，将载玻片浸泡在茯苓多糖液中25分钟，以 对载玻片上物质作固定处理；茯苓多糖液是由每10毫升生理盐水中加入1克茯苓多糖配置 而成；

⑦用磷酸盐缓冲液（PBS）浸洗步骤⑥所述固定后的载玻片二次，每次5分钟；然后将浸 洗后载玻片在10毫升0.2%的TritonX-100中浸洗处理5分钟，之后再用磷酸盐缓冲液浸洗 二次，每次5分钟；

⑧用50微升TdT和450微升荧光素标记的dUTP液混匀制备混合液；将经步骤⑦处理后 的数块载玻片分成阴性对照组和阳性对照组，其中向阴性对照组的每块载玻片加50微升 荧光素标记的dUTP液；阳性对照组的每块载玻片先加入100微升DNase1，反应在15~25℃ ×10分钟，之后将每块载玻片在0.2%的TritonX-100中处理，10毫升中浸洗5分钟，再用PBS 浸洗二次，每次5分钟；阴性对照组和阳性对照组的所有载玻片干后在暗湿盒中反应37℃× 30分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟；暗湿盒是密闭避光、湿度在80%以上的盒子；

⑨将步骤⑧最终处理后的所有载玻片加50~100微升二氨基联苯胺（DAB）底物，反应15~ 25℃×10分钟；

⑩将步骤⑨处理后的载玻片用苏木素或甲基绿复染，5秒后立即用自来水冲洗；梯度酒 精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片；在显微镜下观察结果。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测精子细胞凋亡及膜完整性的方法，其特征在于： 步骤①中所述的蒸馏水是双蒸水。

3.根据权利要求1所述的一种同时检测精子细胞凋亡及膜完整性的方法，其特征在于： 步骤中所述显微镜为德国产Leica牌DM4000B型显微镜。

4.根据权利要求1所述的一种同时检测精子细胞凋亡及膜完整性的方法，其特征在于： 步骤⑨中所述的二氨基联苯胺（DAB）底物是二氨基联苯胺显色剂，加入后自然光显微镜下 观察精子。