[发明专利]基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶的抗凝血药及其应用

说明书

基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶，所述蛋白酶是从中华眼镜蛇又称舟山种眼镜蛇，分类名：Naja atra的蛇毒中分离纯化获得；所述蛋白酶是单链糖蛋白，结构解析表明具有3个结构域：金属蛋白酶结构域、去整合素样结构域、富含半胱氨酸结构域，属于PIII型蛇毒金属蛋白酶。其名称分别为Atrase A和Atrase B，其序列为：AtraseA：SEQIDNo.1；AtraseB：SEQIDNo.2。目标蛋白和其抗凝血药具有多重抗凝作用：抗多种凝血因子；降低纤维蛋白原水平；抗血小板聚集；抗补体从而减轻病理生理情况下炎症诱发的异常凝血。

技术领域

本发明涉及眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶的应用领域，特别涉及一种基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶的抗凝血药及其应用。

背景技术

蛇毒金属蛋白酶(snake venom metalloproteinase，SVMP)属于金属蛋白酶M12家族Reprolysin成员，主要存在于蝰科和响尾蛇科蛇毒中，其结构中共有的显著特点是在酶的活性中心含有一段“HEXGHXXGXXHD”的保守序列，锌离子与该保守区结合。SVMP的显著毒性特征是具有出血毒性，多具有水解细胞基底膜和细胞外基质、抗凝、促凝、抗血小板聚集等活性，在血循毒类蛇毒的毒性作用中扮演了重要角色。根据分子量大小和所含结构域数目可以将蛇毒金属蛋白酶分为4类：PI型蛇毒金属蛋白酶仅含有一个金属蛋白酶结构域；PII型含有一个金属蛋白酶结构域和一个去整合素或类去整合素结构域；PIII型比PII型多一个富含半胱氨酸结构域，而PIV型在C端还存在第四个结构域-C型凝集素样结构域。

迄今为止，从不同种的眼镜蛇毒中分离纯化出不多的SVMP，如从中华眼镜蛇(Najaatra)蛇毒中分离获得的atrahagin,mocarhagi、kaouthiagin、NN-PF3(印度眼镜蛇，Najanaja naja)等，从中华眼镜蛇毒中分离获得的具有水解纤维蛋白原的蛋白酶natrahagin。总体上，由于眼镜蛇毒没有表现出明显的蛋白水解酶的活性，因此，针对眼镜蛇毒中的SVMP开展的研究不多。这些从眼镜蛇毒中获得的纤溶酶或SVMP多数都能水解纤维蛋白原的α链，并都表现出抗血小板聚集的活性研究，其抗血小板聚集的主要机制为酶切血小板膜糖蛋白GPIb或vWF，这些蛋白质分子有可能成为抗血小板聚集或降纤维蛋白原的潜在药物分子，而在针对抗凝血因子方面都没有进行研究和报道。

从蝰科和响尾蛇科蛇毒中分离制备获得的SVMP由于其固有的出血毒性，使其无法用于抗凝血药的制备。目前已有的蛇毒来源的抗凝血药均由属于丝氨酸蛋白酶的凝血酶样酶或纤溶酶所制备。

本案中的眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶Atrase A和Atrase B是目前从舟山种眼镜蛇(Naja atra，中华眼镜蛇)蛇毒中经分离纯化获得的仅有的2个经过结构解析鉴定的PIII型金属蛋白酶，Atrase A和Atrase B除具有降解纤维蛋白原α链和酶切血小板膜糖蛋白GPIb的活性外，具有两个显著的特性是其它眼镜蛇毒金属蛋白酶或纤溶酶所不具备的：一是抗凝血因子的活性，二是具有抑制补体激活的活性。凝血因子是凝血系统中重要的功能因子，目标蛋白能抑制多种凝血因子的活性，从而表现出对外源性和内源性凝血途径的有效抑制；补体系统在病理生理条件下的激活与凝血系统功能的失调有密切关联，对补体系统激活的抑制能有效干预凝血功能的异常，目标蛋白能有效抑制补体系统的激活，从而能有效干预因补体系统激活造成的凝血功能异常。因此，以目标蛋白制备抗凝血药，具有其它蛇毒金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶所不具备的独特优点。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶的抗凝血药及其应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶，所述蛋白酶是从中华眼镜蛇又称舟山种眼镜蛇，分类名：Naja atra的蛇毒中分离纯化获得；所述蛋白酶是单链糖蛋白，结构解析表明具有3个结构域：金属蛋白酶结构域、去整合素样结构域、富含半胱氨酸结构域，属于PIII型蛇毒金属蛋白酶