[发明专利]用于将非多能细胞重编程为多能干细胞的改进方法

说明书

本文提供多能性化学诱导剂(CIP)，其包括糖原合成酶激酶抑制剂、TGFβ受体抑制剂、环AMP激动剂和S‑腺苷高半胱氨酸水解酶(SAH)抑制剂或组蛋白乙酰化剂。本文还提供了通过使用这样的多能性化学诱导剂在诱导部分或完全分化的细胞中的多能性的方法。所述方法包括：(i)使细胞与CIP接触足够的时间段以使得将细胞重编程为具有ESC样特征的多能干细胞(CiPSC)。分离的化学诱导的多能干细胞(CiPSC)和通过CiPSC的诱导分化产生的它们的子代可以在多种应用中使用，包括但不限于细胞治疗和组织工程。

发明领域

本发明总体上涉及用于将真核细胞重编程为多能细胞的小分子组合物和方法。

发明背景

多能干细胞，如胚胎干细胞(ESC)，可以自我更新并且分化为所有体细胞类型。已经通过向卵母细胞中的核移植或通过限定因子的异位表达将体细胞重编程而成为多能性的。(Wilmut等，Nature，385：810-813(1997)；Takahashi等，Cell，126：663-676(2006)；Yamanaka等，Nature，465：704-712 (2010)和Stadtfeld等，Genes Dev.，24：2239-2263(2010))。然而，外源多能性相关因子，尤其是Oct4，在这些用于建立多能性的方法中是不可缺少的 (Zhu，Annu.Rev.Biomed.Eng.，13：73-90(2011)；Li，CellRes.，21：196-204 (2011)和Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，109：20853-20858(2012))。此外，在这些重编程方法中对致肿瘤基因(tumorigenic gene)如c-Myc的要求产生了诱导癌细胞的风险。因此，重编程策略已经引起了对临床应用的担忧。(Saha等，Cell Stem Cell，5：584-595(2009)和Wu等，Cell Biol.， 13：497-505(2011))。

在PCT/CN2014/081961中公开了可以驱动体细胞重编程为多能细胞的小分子。小分子具有优点，因为小分子更容易透过细胞，它们是非免疫原性的、更节省成本、并且更容易合成、保存、和标准化。对于例如通过减少总重编程时间和/或增加在相同时间长度内得到的重编程的细胞的数量来增加重编程效率的将非多能细胞化学重编程为多能细胞的方法，仍然存在需求。

本发明的目的是提供可以用于将部分或完全分化的细胞重编程为多能细胞的小分子的组合。

本发明的另一个目的是提供具有提高的效率的将部分或完全分化的细胞重编程为多能细胞的方法。

发明概述

公开了用于提高将非多能细胞化学诱导为多能细胞的效率的组合物和方法。所述方法基于在重编程阶段期间准备用于向多能性转化的中间细胞群体(XEN样细胞)的发现、优先将部分或完全分化的细胞偏置(bias)为 XEN样状态并且随后将XEN样细胞重编程为多能细胞的小分子组合、以及所需的重新接种浓度/密度。因此，通过选择对部分或完全分化的细胞向 XEN样状态的转化进行偏置/富集的小分子，将XEN样细胞重编程为多能细胞的小分子、和适当的重新接种浓度，在所得到的群落数量和重编程时间方面，使部分或完全分化的细胞重编程的效率提高。

因此，已经鉴别了可以用于使部分或完全分化的细胞(包括未被遗传改造以表达一种或多种多能性标记如Oct4并且不自然表达Oct4的细胞)重编程为XEN样状态并且随后重编程为多能细胞增强的小分子混合物。所需的多能性化学诱导剂(CIP)包括(1)糖原合成酶激酶(GSK)抑制剂，(2)TGFβ受体抑制剂，(3)环AMP激动剂，(4)S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAH)抑制剂，(5)组蛋白乙酰化剂/去乙酰化酶抑制剂如丙戊酸(VPA；“V”)，(6)DOT1L 甲基转移酶抑制剂，(7)视黄酸受体(RAR)激动剂，(8)表观遗传调节剂， (9)组蛋白去甲基化抑制剂以及它们的组合。CIP可以单独提供或者作为 CIP组合物而组合提供。一种或多种表观遗传调节剂和视黄酸受体激动剂，例如视黄酸受体配体也可以与CIP一起施用。在一些优选的实施方案中， CIP包含DZNep作为SAH抑制剂。