[发明专利]在体外培养分节丝状菌的方法

说明书

本发明涉及一种培养分节丝状菌菌株的体外方法，其包括将真核宿主细胞与所述分节丝状菌菌株共培养，其中在丰富的组织培养液体培养基中，在低于5％的O₂水平下进行培养，所述丰富的组织培养液体培养基含有包括铁的细菌培养基组分。本发明还涉及用于遗传修饰分节丝状菌菌株的方法，其包括在体外培养菌株的步骤。

技术领域

本发明涉及一种生长分节丝状菌(SFB)的体外方法。本发明还涉及用于遗传修饰SFB菌株的方法。

背景技术

分节丝状菌(Segmented filamentous bacteria，SFB)或分节丝状菌(Candidatusarthromitus)或Candidatus savagella或Arthromitus immunis或小鼠分节丝状菌(Arthromitus muris)是许多脊椎动物物种的肠(回肠末端(distal illeum))中发现的革兰氏阳性厌氧的、梭菌(Clostridia)相关的、形成孢子的共生体，所述脊椎动物物种包括小鼠、大鼠、兔子、鸟(例如，鸡)、鱼、两栖动物以及可能地人(Klaasen等人，1992；Yin等人，2012)。细丝的尺寸为0.5-1000μm长。SFB产生细胞内后代(Schnupf等人，2013；Ericsson等人，2014综述)。一旦形成的细胞内后代是单细胞的，直到它们开始细丝化(filament)并变成双细胞，然后成为三细胞。

对SFB已经获得了很大的兴趣，因为它们具有训练(educate)肠免疫系统和诱导生理性炎症的健康状态的独特能力(Schnupf等人，2013；Ivanov等人，2009)。SFB定植导致肠粘膜淋巴组织的成熟、诱导强的且广泛的IgA应答、刺激T细胞划分(compartment)、上调肠先天性防御调节子(mediators)，并诱导小肠Th17应答显著增加(Schnupf等人，2013；Ivanov等人，2009；Gaboriau-Routhiau等人，2009)。此外，SFB定植对全身应答起辅助作用，并且因此可以加剧脑炎和关节炎小鼠模型的病理，同时保护遗传易感小鼠免受I型糖尿病的发展(Lee等人，2011；Wu等人，2010；Chappert等人，2013；Kriegel等人，2011；Yurkovetskiy等人，2013)。

与其他共生体不同，分节丝状菌密切附着于回肠中的吸收性上皮细胞和覆盖派伊尔斑(Peyer’s patches)的细胞(Jepson等人，1993；Chase等人，1976)。这种定植不会导致病理；相反，它保护宿主免受病原体(Ivanov等人，2009)。

几种SFB菌株的基因组是本领域已知的。最近测序的大鼠和小鼠SFB基因组显示SFB的高度营养缺陷需求，并将SFB置于专性和兼性共生物(symbionts)之间(Pamp等人，2012)。这些发现表明，SFB从它们与宿主的相互作用中获得至少一些营养需求(Prakash等人，2011；Sczesnak等人，2011；Kuwahara等人，2011；Pamp等人，2012)。

然而，关于作为细菌的重要免疫刺激性能的基础的分节丝状菌-宿主相互作用的了解甚少，因为SFB已经抵抗体外培养50多年。

因此，需要一种在体外培养SFB的有效方法。

发明内容

本发明人已经在SFB的宿主以外的分节丝状菌-宿主细胞共培养系统中生长小鼠SFB。本发明人已经显示，在该系统中，从单定植(monocolonized)小鼠分离的单细胞SFB经历细丝化(filamentation)、分节(segmentation)并分化以释放活的感染性颗粒、单细胞的细胞内后代，其可以定植小鼠以诱导特征性免疫应答。本发明人还在该共培养系统中观察到SFB孢子的形成。在体外，细胞内后代可以附着于小鼠和人宿主细胞，并募集肌动蛋白。此外，SFB可以有力地刺激宿主先天性防御基因、炎性细胞因子和趋化因子的上调。SFB的这些免疫刺激性能增加了宿主对病原体的抗性，并且可以被利用以指导针对感兴趣的特定病原体的免疫。