[发明专利]通过使用由靶材料调节的核酸聚合酶的活性用于检测和量化生物材料的方法

说明书

本发明涉及使用由靶材料调节的核酸聚合酶活性检测和量化生物材料的方法，且更具体地涉及用于检测或量化生物材料的方法，所述方法能够以高灵敏性检测和量化核酸、蛋白、小分子材料、生物活性材料(酶活性)等，所述检测和量化根据特异性核酸是否特异性结合的DNA聚合酶的活性变化实现，所述特异性核酸与所制备的DNA适体形成复合物以包含特异性识别所述特异性核酸的单链DNA。本发明可提供用于检查生物材料的方法，所述方法能够无标记且灵敏地检测和量化靶核酸、靶蛋白、靶小分子材料、靶酶活性等，所述检测和量化通过由靶材料诱导的DNA适体的结构变化调节聚合酶的活性来实现。

技术领域

本发明涉及使用由靶分子控制的核酸聚合酶活性检测和量化生物分子的方法，且更具体地涉及用于检测或量化生物分子的方法，其可以高灵敏性检测和量化核酸、蛋白、小分子物质、生理活性物质(酶活性)等，所述检测或量化以由特异性核酸的特异性结合引起的DNA聚合酶活性的变化为基础，所述特异性核酸与所制备的DNA适体(aptamer)形成复合物适体以包含特异性识别所述特异性核酸的单链DNA。

背景技术

基于核酸的检测技术在疾病诊断、药物检测、环境监测和刑事调查中起重要的作用，且对于具有出色灵敏性和特异性并便于使用的新型检测技术存在持续的需求。已在现有技术中常规使用的基于核酸的检测技术基于为U形DNA探针的分子信标(molecularbeacon)，所述U形DNA探针用荧光团和淬灭剂标记。该技术包括确认荧光信号是否由分子信标的构象变化产生，所述分子信标的构象变化由靶核酸的存在导致(Tyagi et al.,Naturebiotechnology,14:303-308,1996；Masuko et al.,Nucleic Acids Research,26:5409-5416,1998)。由于该技术可迅速分析靶核酸而无需分离核酸，其被广泛使用，且已开发了多种类型的基于分子信标的核酸分析技术(Song et al.,Angewandte Chemie-International Edition,48:8670-8674,2009；Wu et al.,BiosensorsBioelectronics,26:3870-3875,2011；Yeh et al.,Nano Letters,10:3870-3875,2011)。然而，上述基于分子信标的分析技术具有的不足在于，由于靶核酸和分子信标以1:1的比率反应以生成荧光信号，难以实现较高的灵敏性。

近年来，出于克服该问题并开发具有出色灵敏性的检测传感器的目的，已对使用酶作为工具用于信号放大做出了尝试。典型的实例包括其中酶以检测探针标记用于检测靶核酸的系统，且其中引入了抑制剂(Gianneschi et al.,Angewandte Chemie-International Edition,46:3955-3958,2007；Saghatelian et al.,Journal of theAmerican Chemical Society,125:344-345,2003；Pavlov et al.,Journal of theAmerican Chemical Society,127:6522-6523,2005；Niemeyer et al.,AngewandteChemie-International Edition,49:1200-1216,2010)。在该系统中，通过与检测探针的杂交，靶核酸的存在阻断抑制剂的抑制功能，且恢复的酶活性生成高荧光信号。然而，该技术具有的不足在于，其需要使用抑制剂标记酶的步骤，耗时长且需要很多技巧。此外，其不足还在于标记操作本身可能引起酶构象的变化从而降低酶的活性。此外，该技术具有的局限在于，其难以用作用于检测多种靶核酸的通用技术，这是由于其需要为每种靶核酸制备酶-抑制剂复合物。因此，需要开发无标记的基于酶的技术用于检测多种靶核酸。