[发明专利]使用由两个载体表达的拆分的Cas9的基因组编辑

说明书

本发明涉及一种用于调节基因表达的方法，该方法包括将表达包含Cas9蛋白质的N末端的第一结构域的重组载体和表达包含Cas9蛋白质的C末端的第二结构域的重组载体中的每个都导入到细胞中，本发明还涉及一种包含所述重组载体的组合物，一种用于调节基因表达的试剂盒，以及一种用于在细胞内制备Cas9蛋白质的方法。此外，本发明涉及一种导入了包装第一结构域的病毒载体和包装第二结构域的病毒载体的转化细胞，并且涉及一种包含由该转化细胞制备的病毒的组合物。

技术领域

本发明涉及一种用于调节基因表达的方法，该方法包括将表达包含Cas9蛋白质的N末端的第一结构域的重组载体和表达包含Cas9蛋白质的C末端的第二结构域的重组载体中的每个都导入到细胞中；本发明涉及包含重组载体的组合物；用于调节基因表达的试剂盒和用于细胞内制备Cas9蛋白质的方法。

此外，本发明涉及被导入了包装第一结构域的病毒载体和包装第二结构域的病毒载体的转化细胞并涉及包含由其制备的病毒的组合物。

背景技术

限制酶作为当前广泛用于基因工程的工具，是当前分子生物学研究中最重要工具之一。然而，由于出现了对于可用于处理基因组大小的DNA且用作能够识别和切割长度为9bp或以上的DNA核苷酸序列的″稀有切割器″的限制酶的需要，所以已经进行了各种尝试。

作为此类尝试的一部分，开发了人工核酸酶，诸如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)和TAL效应子核酸酶(TALEN)，该人工核酸酶是能够诱导细胞和微生物中的内源基因突变、靶基因插入和染色体重排的工具。这些人造核酸酶可以有效地用作各种领域(包括基因工程领域、生物技术领域和医疗领域)中的强力和通用工具。作为使用被称为微生物免疫系统的CRISPR/Cas系统的第三代可编程核酸酶的RGEN(RNA引导的工程化核酸酶)的最新发展已经引起在生物技术领域中的所有方面上的新发现和创新(Kim，H等人，《自然评论：遗传学》，2014年第15卷，第321页至334页)。

如上所述的人造核酸酶识别细胞中的特异性靶核苷酸序列以诱导DNA双链断裂(DSB)。诱导的细胞内DSB可以通过细胞的内源性DNA修复机制(同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ))修复，其中发生靶特异性突变和基因修饰。当同源DNA供体不存在于真核细胞和生物体中时，由核酸酶诱导的DSB可以主要由NHEJ机制而非HR机制修复。HR介导的突变发生在HR供体DNA中的序列正确拷贝时，但NHEJ介导的突变随机发生。因为NHEJ是易错的修复机制，所以在发生DSB的区域中可发生少量插入/删除突变(插入缺失突变)。此类突变诱导移码突变，从而导致基因突变。

具体地，CRISPR/Cas系统的Cas9蛋白质是设计真核细胞和生物体中基因修饰的有用工具。然而，编码Cas9蛋白质的基因的大小很大，并且为此，当将Cas9蛋白质插入用于细胞内递送的病毒载体中时，存在这样的问题：由于病毒载体的有限包装能力，病毒制备效率低并且细胞内递送的效率低。因此，需要聚焦在通过病毒载体表达Cas9蛋白质的研究。

发明内容

技术问题

本发明人已经进行了广泛努力来克服病毒载体的有限包装能力并且开发出能够通过病毒载体表达Cas9蛋白质的系统。因此，本发明人已经将Cas9蛋白质分割成两个可包装到病毒载体中的结构域，并且已经构建能够表达结构域中的每个的重组载体。此外，本发明人已经发现，当重组载体导入到细胞中时，结构域彼此融合以表现出对基因组靶DNA的插入缺失(插入或删除)效应，从而完成本发明。

技术方案

本发明的目的在于提供用于调节基因表达的方法，该方法包括将表达包含Cas9蛋白质的N末端的第一结构域的重组载体和表达包含Cas9蛋白质的C末端的第二结构域的重组载体中的每个都导入到细胞中。

本发明的另一个目的在于提供组合物，该组合物包含表达包含Cas9蛋白质的N末端的第一结构域的重组载体和表达包含Cas9蛋白质的C末端的第二结构域的重组载体。